[发明专利]一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制、鉴定方法

权利要求书

1.一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制方法，其特征在于，首先利用黄瓜-酸黄瓜种间杂交异源四倍体与二倍体栽培黄瓜回交两次得到黄瓜-酸黄瓜单体异附加系，再通过黄瓜-酸黄瓜单体异附加系自交，经分子标记方法和基因组原位杂交方法筛选出黄瓜-酸黄瓜二体附加系。

2.根据权利要求1所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、黄瓜-酸黄瓜种间杂交异源四倍体与二倍体栽培黄瓜回交得到异源三倍体；

S2、异源三倍体与二倍体栽培黄瓜回交获得候选异附加系，候选异附加系通过基因组原位杂交筛选出单体异附加系；

S3、将筛选出的单体异附加系进行自交，自交后代首先通过分子标记方法继续筛选异附加系植株；然后通过基因组原位杂交方法筛选出携带两条酸黄瓜外源染色体的异附加系植株即为黄瓜-酸黄瓜二体附加系。

3.根据权利要求1或2所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制方法，其特征在于，所述黄瓜-酸黄瓜种间杂交异源四倍体基因组为HHCC，H代表酸黄瓜基因组，C代表黄瓜基因组，染色体数为2n＝4x＝38。

4.如权利要求1所述方法创制的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的鉴定方法，其特征在于，黄瓜-酸黄瓜单体异附加系进行自交，自交后代首先通过分子标记方法筛选异附加系植株；然后通过基因组原位杂交方法筛选出携带两条酸黄瓜外源染色体的异附加系植株即为黄瓜-酸黄瓜二体附加系；具体包括以下步骤：

1)提取黄瓜-酸黄瓜单体异附加系自交后代植株的基因组DNA，利用鉴定酸黄瓜外源染色体的特异分子标记的引物对对基因组DNA进行PCR扩增，根据电泳分离的结果判定目的片段的大小；

所述酸黄瓜外源染色体为酸黄瓜10号染色体，用于鉴定酸黄瓜10号染色体的特异分子标记为SSH10，特异分子标记引物对的核苷酸序列如下：

正向引物：5′-CCCTACAACTTCCCCTAT-3′；

反向引物：5′-TTCCTCTTCTTGGCTAAT-3′。

2)对产生酸黄瓜染色体特异性条带的植株材料取有丝分裂旺盛部分根尖进行有丝分裂染色体的制备，选择染色体清晰、背景干净的片子待测；

将待测的片子滴加100μL 70％的去离子甲酰胺，盖上玻片放于80℃的杂交仪上变性90s，变性完成后，立即甩掉盖玻片，将片子在-20℃条件下用70％、90％和100％的乙醇溶液依次脱水5min后晾干；总共20μL的杂交混合液放入90℃的金属浴中变性6min，变性后放入冰上10min；将变性后的杂交混合液滴至经变性晾干后的载玻片上，盖上盖玻片后放置37℃杂交仪中杂交过夜；洗片后室温风干，加入20μL 0.02mg/ml DAPI复染后封片，盖玻片封片后在避光的条件下，荧光显微镜观察杂交信号。

5.根据权利要求4所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，所述PCR反应体系为20μL，包括10×PCR Buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl₂ 1.2μL，150μmol/LdNTPs 2.0μL，0.67μmol/L标记引物各1.0μL，40ng/μL样品DNA 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补足至20μL；

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，29个循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求4所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中，所述杂交混合液包括50％的去离子甲酰胺、2×SSC、10％硫酸葡聚糖及已标记的探针。

7.根据权利要求6所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的鉴定方法，其特征在于，所述探针为hy-gDNA探针。

8.权利要求1所述创制方法在黄瓜育种中的应用。

9.权利要求4所述鉴定方法在筛选黄瓜-酸黄瓜二体附加系进行黄瓜育种中的应用。