[发明专利]一种基于水凝胶的细胞固定相制备方法

说明书

本发明公开了一种基于水凝胶的细胞固定相制备方法，利用琼脂糖溶解及胶凝的温差特性及交联网状结构特点将活细胞固定于水凝胶中作为细胞固定相，制备成亲和仿生色谱柱。制备方法简单，条件温和，既保持了细胞的生理活性，同时温和无损地固定了细胞。应用本方法制备的细胞固定相可应用于药物筛选，提高药物筛选的特异性和有效性。

技术领域

本发明属于亲和色谱领域，特别是涉及仿生筛选技术领域。

背景技术

固定化细胞色谱法是王嗣岑教授及其团队提出的一种仿生亲和色谱方法，适用于中药 复杂体系中活性成分的筛选，该方法以微载体与细胞共同培养后，经多聚甲醛固定后制备 成细胞色谱柱，结合HPLC/MS从中药中筛选鉴定活性成分，是一种快速高效的筛选方法。 然而，固定化细胞色谱法也存在一些局限性。首先细胞经过多聚甲醛固定后失去活性，并 且部分受体活性位点被破坏，不足以完全模拟体内药物与细胞的实际作用情况；其次，微 载体粒径较大，经过水化后直径为120-150μm，在色谱过程中易造成涡流扩散，影响活性成分的富集和鉴定，另外，微载体结构会产生非特异性吸附，影响活性成分识别的准确性。

琼脂糖由重复的d-半乳糖和3,6-内醚-L-半乳糖组成，是一种天然的多糖聚合物，其凝 胶具有稳定性好、对多种生物化合物的非特异性吸附低、孔径大、易于修饰固定结合剂等 优点。琼脂糖凝胶与细胞外基质相似，且对氧和营养物质有可控的渗透能力，具有良好的 生物相容性，为仿生环境中生长的细胞提供了三维空间环境。但由于其机械稳定性差，使 得其难以应用于传统液相色谱中。以活细胞建立色谱方法必须减少色谱环境对细胞的损 伤，因此其色谱条件可适用于机械稳定性低的材料，是琼脂糖水凝胶在色谱领域的发展应 用方向。琼脂糖溶解及胶凝的温度差可以为活细胞提供良好的固定环境，其自封闭性能可 以围绕细胞形成凝胶及网孔。利用琼脂糖凝胶固定活细胞制备色谱柱易于维持细胞活性， 并且成本低。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种仿生细胞色谱方法，能够解决体外模拟体内药 物与细胞相互作用的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种基于水凝胶的细胞固定相 制备方法，包括色谱柱的一体化制备，溶解多巴胺于Tris-HCl中，使多巴胺质量浓度为2 g/L，振荡氧化，移入色谱柱内反应修饰；将琼脂糖粉末加热溶解，稀释至浓度0.5％-2％ (W/V)并摇匀，放置降温，其温度不低于37℃，得到水凝胶液体；培养收集对数期细胞，离心得到细胞沉淀；当水凝胶液体降温至活细胞可耐受的温度范围并且保持液体状态时，吸取液体吹悬细胞沉淀，摇匀并迅速转移至色谱柱管内，降温胶凝，制备成细胞色谱柱。

所述的对数期细胞包括一种类型细胞和多种类型的细胞。所述的基于水凝胶的细胞固 定相在筛选与固定相中细胞相互作用的药物发现中的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供的基于水凝胶的细胞固定相制备方法，以完整细胞 代替细胞膜色谱法中的细胞膜碎片，解决了细胞膜层在固定相中没有内外表面的区分而造 成受体分布与原细胞上的显著不同的问题，对细胞和药物的结合作用更有说服力。

本发明提供的基于水凝胶的细胞固定相制备方法，以琼脂糖水凝胶代替固定化细胞色 谱法中的微载体，将载体的比表面积最大化，可为仿生固定相提供更充足的细胞及受体数 量，从而提升亲和筛选的准确性；以水凝胶代替微载体，为整个色谱过程中的细胞提供适 宜的生存环境，保证了细胞的活性，可动态模拟药物分子与细胞的体内相互作用，可更高 效地发现具有体内生物活性的候选分子。

本发明提供的基于水凝胶的细胞固定相制备方法，通过琼脂糖水凝胶的自封闭细胞性 能固定细胞，并形成交联网状结构为流动相的流动提供条件，固定条件温和，并且解决了 细胞容易从固定相表面脱落的问题。

与现有技术相比，本发明提供的基于水凝胶的细胞固定相制备方法，操作简单，成本 低廉，制备的固定相更高程度地模拟体内药物与细胞相互作用情况，筛选活性化合物更高 效、准确。

附图说明