[发明专利]免疫组库标准物质序列及其设计方法和应用

说明书

本发明涉及一种免疫组库标准物质序列及其设计方法和应用，属于免疫组库检测技术领域。该免疫组库标准物质序列，由5’端到3’依次包括：V基因参考序列、CDR3模拟序列、J基因参考序列和C基因参考序列；所述CDR3模拟序列在真实样本中出现的概率≤0.01％，所述CDR3模拟序列包括1‑3段识别标签序列以及0‑1段水印序列；所述标签序列用于识别区分所述免疫组库标准物质序列，所述水印序列用于标识所述免疫组库标准物质序列的来源。该序列通过人工设计合成，为模拟淋巴细胞受体基因的免疫组库标准物质，可通过该标准物质作为模拟样品，进行多重PCR引物体系的调整和验证，从而减小多重PCR带来的偏差，更精准的反应样本的免疫组库各克隆分布情况。

技术领域

本发明涉及免疫组库检测技术领域，特别是涉及一种免疫组库标准物质序列及其设计方法和应用。

背景技术

免疫组库(Immune Repertoire，IR)被定义为在任何特定时间下，机体适应性免疫系统的T淋巴细胞表面受体和B淋巴细胞表面受体(抗体)的总和。机体的适应性免疫主要是由淋巴细胞(包括T淋巴细胞和B淋巴细胞)发挥功能，具备抗原特异性的特点，这种抗原特异性是由淋巴细胞表面的抗原受体所决定的。

T细胞主要参与细胞免疫，其特异性由T细胞受体(T cell receptor，TCR)编码基因的特异性决定；B细胞主要通过抗体参与体液免疫，其特异性由B细胞受体(B cellreceptor，BCR)或称抗体(immunoglubin，IG)编码基因的特异性决定。

BCR由两条重链和两条轻链构成，TCR由含量占绝大部分的α、β链(95％～99％)和含量较低的γ、δ链(1％～5％)组成，每条链又由多个V、D、J、C基因共同编码。在人体细胞的染色体上，每条链都有数十种V基因、D基因和J基因的编码基因，在T/B细胞成熟过程中，会发生VDJ基因的重排，在重排过程中随机选取一种V、D和J基因串联在一起，组成TCR/BCR的可变区，同时还会在接合部位发生碱基的随机的插入和删除，因此几乎每个新产生的T/B细胞的TCR/BCR基因都各不相同，组成数量庞大的TCR/BCR免疫组库，赋予机体识别各种不同抗原的能力。

通过高通量测序(HTS)对TCR/BCR的编码基因进行分析，可以对免疫组库进行解码，用于对免疫系统的多样性和特异性进行分析，已经广泛的用于基础研究及转化研究，在个别领域也已经转化成临床检测产品。目前，分析免疫组库的主要的两种方法是5’RACE和多重PCR，5’RACE方法只适用于RNA样品，而多重PCR既适用于RNA，也适用于DNA。

上述多重PCR是指在一管反应中使用多对引物对多个目标片段同时进行扩增的技术，为实验研究节约了大量时间和成本，被广泛应用于核酸诊断、基因缺失分析、突变和多态性分析、定量分析等研究，同时在病原学研究中包括病毒、细菌、真菌和寄生虫鉴定表现出了巨大的潜力。

通过多重PCR技术对免疫组库进行分析，同时适用于DNA和RNA，且与5’RACE相比成本相对低廉，是用于免疫组库研究的最常见方法。该技术通过针对V区家族和J区/C区家族设计的多条引物直接对DNA或者RNA逆转录的cDNA进行目标区域扩增，然后测序获得样本中的所有TCR/BCR基因编码序列。

多重PCR作为免疫组库的重要研究方法，虽然具有高效、低成本的优势，但是多重PCR扩增由于在同一个反应体系中多对引物的结合效率差异及引物间可能存在的相互作用，会带来不同模板的扩增效率的偏差，这种偏差使得得到的数据不能真实反映样品中每个T细胞或B细胞克隆的真实情况。

发明内容

基于此，有必要针对问题，提供一种免疫组库标准物质序列，以TCR及BCR编码基因参考序列以及健康人群中的TCR/BCR分布规律为基准进行设计，使用此标准物质模拟T/B细胞受体库，对多重PCR引物体系进行比例调整优化，以达到减小偏差的目的。