[发明专利]检测人B-raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测人类B-raf基因V600E突变的引物，其特征在于，包括正向引物与反向引物，正向引物包含沿5'端到3'端按以下顺序排列的三个部分：

1）第一序列，用于识别突变位点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，该序列与野生型模板序列完全匹配，与突变型模板序列有一个碱基错配；

2）Spacer，连接第一序列的3'末端和第二序列的5'末端；

3) 第二序列，与突变位点上游的序列结合，其3'端序列的3-6bp与第一序列的5'端重叠；

所述第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高6.3℃~11.3℃；

所述第一序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，Spacer 为C3，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

或所述第一序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第二序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，Spacer 为C6，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

或所述第一序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第二序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，Spacer 为C18，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.一种用于检测人类B-raf基因V600E突变的引物探针组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述用于检测B-raf基因V600E突变的引物以及检测探针，所述检测探针为MGB探针，探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团MGB，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

3.根据权利要求2所述的用于检测人类B-raf基因V600E突变的引物探针组合物，其特征在于，还包括内部质控引物及内部质控探针：

所述内部质控引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14以及SEQ ID NO.15所示；

所述内部质控探针为TaqMan探针，探针的5'端标记荧光报告基团VIC，3'端标记荧光淬灭基团BHQ1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

4.一种用于检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的引物探针组合物。

5.根据权利要求4所述的检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，还包括10×PCR检测反应液，所述10×PCR检测反应液包括pH值为9.0的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为25mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的曲拉通溶液和浓度为50mmol/L的二硫苏糖醇溶液。

6.根据权利要求4所述的检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，还包括酶混合液，所述酶混合液包括1U/μL～5U/μL的耐热DNA聚合酶和0.05U/μL～0.2U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶。

7.根据权利要求4所述的检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品，所述阳性对照为包含内部质控序列片段的质粒和B-raf V600E突变位点所在区域片段质粒的混合物，所述内部质控为人类原癌基因，序列信息：NM_001378473.1，所述B-raf V600E突变位点所在区域核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

8.根据权利要求4所述的检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照品，所述阴性对照为灭菌生理盐水。