[发明专利]双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体及其在催化合成L-草铵膦中的应用

说明书

本发明公开了双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体及其在催化合成L‑草铵膦中的应用，该双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第91位、第111位、第240位和第261位进行多点突变后获得。本发明不仅改变了草铵膦脱氢酶突变体的辅酶依赖性，由原来NADPH依赖性改为NADH/NADPH双依赖性，而且也对草铵膦脱氢酶催化活性进行了改造，活力有了较大提升，并将突变体进一步组合，获得了高活力菌株，催化制备的L‑草铵膦转化率高、收率高、产物易于分离提纯且显著缩短了反应进程。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体及其在催化合成L-草铵膦中的应用。

背景技术

草铵膦(glufosinate-ammonium)化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂是谷氨酰胺合成酶抑制剂。

众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；中国农业部已发布公告说明，百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；全球越来越多国家禁用或限用。而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。

手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。

化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。

生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：

(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本加高，不利于工业化生产。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。

(2)以外消旋草铵膦的前提为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。例如一种采用α-胰凝乳蛋白酶拆分双丙氨膦乙酯制备L-草铵膦的方法，该法首先经过3步反应将外消旋的草铵膦合成双丙氨膦二乙酯，接着用碱性mesinterico肽酶将其C端脂基水解。再经α-胰凝乳蛋白酶催化水解肽键。在该步反应中，α-胰凝乳蛋白酶能选择性水解L-双丙氨膦乙酯，生成L-草铵膦乙脂。最后利用磷酸二脂酶水解P端酯基得到L-草铵膦。