[发明专利]一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法

说明书

本发明的目的在于提供一种快速、简便、经济地检测纯硫氧还蛋白还原酶、细胞和体内组织中硫氧还蛋白还原酶活性的新方法。利用水溶性的硫氧还蛋白还原酶底物(TRS)分子4‑氨基‑1，2‑二硫戊环类化合物，代替经典的硫氧还蛋白联用胰岛素终点法检测硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性，本发明所述的TRS检测TrxR活性的方法，具有很好的创新性性(首次发展的具有专一选择性的TRS分子；首次将其应用于TrxR活性的检测)、经济环保性(降低原有方法的成本)，在体外纯TrxR、细胞内TrxR和体内组织TrxR活性检测方面具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及化学医药领域，具体而言，涉及一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法。

背景技术

硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin Reductase,TrxR)、硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)和NADPH组成。在生物体内TrxR从NADPH获取电子，使其内源性底物Trx处于还原状态，进而保证下游一系列氧化还原信号通路的正常运行(Trends PharmacolSci,2017,38:794-808.)。因此，Trx系统在调节生物体内氧化还原信号通路和维持正常的氧化还原水平中扮演非常重要的角色。

1977年人类首次从牛的组织中分离纯化出TrxR，并且发现哺乳动物的TrxR可以催化机体的许多生化反应(J Biol Chem,1977,252(13):4600-6.)。Stadtman等人于1996年从人的T-细胞及肺癌细胞中分离纯化出TrxR，并探知它是一种含硒的蛋白质(Proc NatlAcad Sci U S A,1996,93(3):1006-11.)。从此科学家对硫氧还原蛋白系统的研究也越来越热并取得了一定成果。比如研究发现Trx系统与多种疾病如癌症、糖尿病、神经退行性疾病和老年性高血压等息息相关(Trends Pharmacol Sci,2017,38:794-808.)。TrxR和Trx的活性极有可能作为检测这些疾病的生物标志，所以发展检测TrxR活性的工具分子和方法很有临床意义。

经典的检测生物体内TrxR活性的方法是Trx联用的胰岛素(Insulin)终点法，该方法主要原理是，在待测样品中，通过额外引用过量的NADPH、Trx和胰岛素，使得TrxR还原Trx这一步成为整个循环反应的决速步骤。TrxR将Trx还原后，Trx进一步特异性将胰岛素还原生成巯基。最后通过巯基检测试剂DTNB滴定反应中生成的巯基量间接反应待测样品中TrxR活性(Methods Enzymol,1999,300,226-239.)。尽管该方法在研究TrxR生物功能和靶向TrxR的药物研发中得到广泛的应用，但是在该方法中所使用的Trx和胰岛素价格昂贵，在一定程度上限制了这一方法的应用。因此发展一种能快速、简便且经济的检测TrxR活性的方法对TrxR的生物功能探究和靶向硫氧还蛋白系统的药物研发至关重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明所述的一种能快速、简便且经济的检测TrxR活性方法的设计思路为：设计一种能够快速且专一的识别TrxR的硫氧还蛋白还原酶底物(ThioredoxinReductase Substrate,TRS，图1)分子，利用TrxR结构中暴露于蛋白表面的硒半胱氨酸(Sec)将TRS中二硫键还原成巯基，最后利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)滴定巯基，以反映体系中的TrxR活性。

为解决上述问题，本发明所述的一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法，具体步骤如下：

(1)基于以上设计思路，设计能够识别TrxR的TRS类分子。

(2)TRS类分子对TrxR响应考察，以选择理想的TRS。

(3)TRS类分子对TrxR专一性考察，以选择理想的TRS。

(4)所选的TRS分子检测TrxR活性的方法建立。

(5)TRS分子检测TrxR活性方法的应用。