[发明专利]一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法及用途

说明书

本发明实施例公开了一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法及用途，属于细胞培养技术领域。所述方法包括：TIL细胞的预培养；TIL细胞的培养与扩增。本发明在不分离胶质瘤浸润淋巴细胞的情况下直接诱导培养TIL细胞后再进行大量扩增TIL细胞，操作程序较为简单且耗时短，能够明显提高TIL细胞扩增数量和细胞活性，具有良好的杀伤胶质瘤肿瘤细胞的效果。本发明在TIL细胞培养和扩增步骤中，采用低浓度的细胞因子复合营养培养基，既保证TIL细胞培养扩增的需要，也降低了后续治疗过程中细胞因子风暴的潜在危险。

技术领域

本发明实施例涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法及用途。

背景技术

胶质瘤是源发于脑神经上皮最常见的原发性颅内肿瘤，难根治，易复发是其主要特点。目前主要的治疗方法是手术治疗、放疗和化疗等。高级别胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤的5年生存期小于10％。

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是从肿瘤组织中分离出的淋巴细胞。现有的TIL 细胞培养技术，是使用机械处理和/或酶消化的方法，从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞，加入高剂量白细胞介素-2(IL-2，6000U/mL)进行体外培养。研究表明，经IL-2活化的TIL与来自自身外周血单个核细胞(PBMC)的LAK 相比，具有更高的杀瘤活力和更好的靶向性。

TIL细胞作为一种特异性免疫细胞，其用于肿瘤治疗已有20多年的历史，在多种肿瘤中已有相关的研究。目前常用的TIL体外扩增技术是先从肿瘤组织中分离出TIL细胞后再进行TIL诱导培养，并已证实体外培养的TIL细胞具有抗肿瘤的作用。但现有扩增TIL细胞需要先分离TIL细胞，存在扩增速度慢，获得淋巴细胞数量少等缺陷，并且为了快速获得更多的效应细胞，细胞因子(如 IL-2)剂量较高，在治疗过程中容易使患者产生因子风暴，因此不利于治疗，甚至对患者产生生命危险。

检索现有技术尚未见胶质瘤TIL的相关报道，因此，开发出一种新的高效体外扩增胶质瘤TIL的方法有着重要的意义。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法及用途，以解决现有TIL细胞扩增方法存在的操作程序繁杂、耗时长、活性不高以及IL-2使用量较高的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法，所述方法包括以下步骤：

(1)TIL细胞的预培养

胶质瘤组织用PBS冲洗后切成1-3mm³大小的组织块，采用预培养液，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，使组织块毛细血管中的PBMC充分释放出来；

(2)TIL细胞的培养与扩增

步骤(1)得到的胶质瘤组织，采用TIL细胞培养基Ⅰ中，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，每2～3天换液一次，培养6-8天后，添加TIL细胞培养基Ⅱ，继续培养6-8天后，在800-1000rpm/min下离心5-8min，弃去上清液，用预培养液重悬浮和洗涤细胞，分离纯化收集TIL细胞以备下一步实验使用。

进一步地，所述预培养液的组成如下：在RMPI 1640培养基的基础上，添加1％P/S(青霉素/链霉素)。

进一步地，所述TIL细胞培养基Ⅰ的组成如下：在GMP DC培养基的基础上，添加5％human A/B serum、1％人血小板裂解物、1％P/S、2mM L-glutamine、1×MEM-Eagle、1mMSodium pyruvate、10mM HEPES、1×β -mercaptoethanol、500U/mL IL-2、50U/mL IL-15、50U/mL IL-21。