[发明专利]一种对柠檬酸杆菌O4和O24血清型O抗原分子分型的检测方法

说明书

本发明涉及对杨葛氏柠檬酸杆菌（Citrobacter youngae）O4血清型及沃克曼氏柠檬酸杆菌（Citrobacter werkmanii）O24血清型的O抗原使用基于MGB探针的实时荧光TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系进行分析。以柠檬酸杆菌O抗原基因簇内的特异基因，设计并筛选了用于杨葛氏柠檬酸杆菌及沃克曼氏柠檬酸杆菌的O抗原分型的引物及MGB探针，为在水、土壤、食物和人或动物肠道中柠檬酸杆菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的MGB探针来检测水、土壤、食物和人或动物肠道中的柠檬酸杆菌，并且对其进行O抗原分型，具有高灵敏度、高特异性及快速检测等诸多优点。

技术领域

本发明涉及对样品中柠檬酸杆菌O4和O24血清型菌株O抗原分型的Taqman-MGB技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的MGB探针进行检测的方法。

背景技术

柠檬酸杆菌，是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，属肠杆菌科。在液体培养基中菌体大小为6.0*1-2μm。通常无荚膜，以周毛运动。代谢方式有呼吸也有发酵代谢。柠檬酸杆菌菌株通常是从动物和人的水，土壤，食物和肠道中分离得到。可能引起菌血症、脑膜炎、败血症、腹膜炎、尿路感染、呼吸道感染和术后感染，尤其是婴儿、6岁以下的未成年儿童和免疫功能低下的人中，对该菌的感染率更高。尤其是侵染性柠檬酸杆菌感染与高死亡率相关，其中33–48％的患者死于柠檬酸杆菌菌血症。由于高分离率，严重感染和高死亡率，柠檬酸杆菌被认为是重要的机会病原体。柠檬酸杆菌与大肠杆菌和沙门氏菌关系最密切，但多样性更高。例如，分离某些对柠檬酸杆菌的分支长度几乎与分离大肠杆菌和沙门氏菌的分支长度一样长。近来开发的几种分型方法，例如脉冲场凝胶电泳，多位点序列分型和限制性片段长度多态性，已被用于检测和分离柠檬酸杆菌临床分离株。但是，基于O抗原变化的血清分型方案仍是临床标本和环境样品中革兰氏阴性病原体检测和鉴定的主流方法。

TaqMan-MGB实时荧光PCR（Real-time fluorescence PCR）技术原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5' 末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan-MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术,它在探针3′ 端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度( Tm值) ，从而使它能够分辨 1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配,就没有信号。探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。 在探针的 5' 末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。 探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25 nt ，Tm在55-60 ℃之间。 产生的PCR产物在50-200 bp之间。 引物由Invitrogen（中国上海）合成。 如果正向引物的3'末端距离探针的5' 末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。