[发明专利]一种对柠檬酸杆菌O4和O12血清型O抗原分子分型的检测方法

说明书

本发明涉及一种对杨葛氏柠檬酸杆菌（Citrobacter youngae,CY）O4血清型和吉伦氏柠檬酸杆菌（Citrobacter gillenii,CG）O12血清型O抗原分型的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。本发明以柠檬酸杆菌O4和O12的O抗原基因簇内的特异基因，即GT和wzx为靶基因，设计并筛选了对柠檬酸杆菌O4和O12的O抗原分型的各自四条引物，为食物水、土壤及肠道中柠檬酸杆菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的LAMP引物检测食物水、土壤及肠道中的柠檬酸杆菌，并且对其进行O抗原分型，具有操作简单、快速高效、高灵敏度等诸多优点。

技术领域

本发明涉及对样品中柠檬酸杆菌O4和O12血清型菌株O抗原分型的LAMP技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的LAMP引物进行检测的方法。

背景技术

柠檬酸杆菌，是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，属肠杆菌科。在液体培养基中菌体大小为6.0*1-2μm。通常无荚膜，以周毛运动。代谢方式有呼吸也有发酵代谢。柠檬酸杆菌菌株通常是从动物和人的水，土壤，食物和肠道中分离得到。可能引起菌血症、脑膜炎、败血症、腹膜炎、尿路感染、呼吸道感染和术后感染，尤其是婴儿、6岁以下的未成年儿童和免疫功能低下的人中，对该菌的感染率更高。尤其是侵染性柠檬酸杆菌感染与高死亡率相关，其中33–48％的患者死于柠檬酸杆菌菌血症。由于高分离率，严重感染和高死亡率，柠檬酸杆菌被认为是重要的机会病原体。近来开发的几种分型方法，例如脉冲场凝胶电泳，多位点序列分型和限制性片段长度多态性，已被用于检测和分离柠檬酸杆菌临床分离株。但是，基于O抗原变化的血清分型方案仍是临床标本和环境样品中革兰氏阴性病原体检测和鉴定的主流方法。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

其技术原理为：60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。