[发明专利]一种对产气肠杆菌PSgc4型菌株的实时荧光PCR检测方法及应用

说明书

本发明涉及一种对产气肠杆菌PSgc4型菌株的实时荧光PCR检测方法及应用。本发明以产气肠杆菌4型多糖抗原基因簇内的特异基因，即orf8为靶基因，设计了对产气肠杆菌血清型PSgc4型菌株的Taqman特异性引物及MGB探针，并建立了针对该菌的实时荧光PCR检测方法。利用本发明提供的方法可以准确、快速、灵敏地对产气肠杆菌PSgc4型菌株进行分子生物学检测。

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于检测产气肠杆菌中最常见血清型PSgc4型菌株的实时荧光PCR检测方法及应用。

背景技术

产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)能引起机会感染和医院内感染，可在患者的呼吸道、泌尿生殖道、脓液和血液等标本中检出，是肠杆菌科肠杆菌属中最常见的临床分离菌之一。近年来，产气肠杆菌的分离率明显增多，特别是在ICU、烧伤科、呼吸内科、泌尿外科等，表明其广泛存在于病区环境，已成为医院感染的重要致病菌之一。已有研究根据编码产气肠杆菌表面多糖抗原的基因簇和特异基因，将产气肠杆菌分为8个血清型（PSgc1-8），其中，PSgc4型为临床上最常见的分离菌株。

TaqMan-MGB实时荧光PCR（Real-time fluorescence PCR）技术原理是，将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光。随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，即可表征检测样品的类型和含量。

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5' 末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan-MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术，它在探针3′ 端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度( Tm值) ，从而使它能够分辨 1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配，就没有信号。探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。 探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25 nt ，Tm在55-60 ℃之间。 产生的PCR产物在50-200 bp之间。 引物由Invitrogen（中国上海）合成。 如果正向引物的3'末端距离探针的5' 末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。

利用Taqman MGB PCR检测时，扩增反应在25 μL的总体积中进行，包括12.5 μLPremix Ex Taq^TM（Takara），0.3 μL各10 μM正向和反向引物，0.3 μL 10 μM探针，0.2 μLROXII，0.3 μL 待检测样品的核酸DNA和11 μL ddH₂O。 一个方案包括在95 ℃下进行3分钟的初始变性步骤，然后在95 ℃下变性15秒，在60 ℃下退火45秒进行40个循环，一式三份进行7500实时PCR 系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），随后利用仪器（如ABI7500）进行检测和结果分析。Ct值26 且出现扩增曲线，则判断样品为阳性，否则为阴性。

发明内容