[发明专利]用于检测SARS-CoV-2的gRNA、引物及试剂盒

权利要求书

1.用于检测SARS-CoV-2的gRNA，所述gRNA包括a)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b)与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述特异性核酸片段包括SEQ ID NO：10和/或11。

2.用于扩增包含权利要求1所述靶核酸的核酸片段的引物，所述引物为SEQ ID NO：5和6所示引物对；和/或；SEQ ID NO：7和8所示引物对。

3.扩增组合产品，其包含权利要求2所述引物；

可选的，所述组合产品还含有等温核酸扩增所用试剂、阳性对照和阴性对照中的一种或多种；

可选的，所述等温核酸扩增所用试剂包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶III、反转录酶、ATP、ATP再生体系所用试剂、pH调节剂、dNTP、各种分子量分布的BSA和/或PEG、以及DTT以及水中的一种或多种；

所述辅助蛋白用于改变重组酶-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于等温核酸扩增进行；

可选地，所述重组酶选自uvsX、RecA以及KX中的至少一种，所述KX的氨基酸序列如SEQID NO：12所示；

可选地，所述单链DNA结合蛋白为gp32；

可选地，所述链置换DNA聚合酶选自BSu DNA聚合酶和/或Sau DNA聚合酶；

可选地，所述辅助蛋白选自uvsY和/或KY，所述KY的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；

可选地，所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、磷酸肌酸及其平衡离子、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖以及蔗糖磷酸化酶中的一种或多种；

可选地，所述等温核酸扩增所用试剂为冻干粉试剂或混合的液体试剂；

可选地，所述等温核酸扩增所用试剂主要活性组分在扩增核酸时的工作浓度在以下范围内：

KX 60～600ng/μL、KY蛋白16～192ng/μL、单链结合蛋白gp32 100～1000ng/μL、链置换DNA聚合酶3～100ng/μL、核酸外切酶III 30～200U、肌酸激酶0.1～0.8mg/ml、磷酸肌酸25～75mM、反转录酶200U、Tris缓冲液20～100mM、PEG 2.5％～10％、醋酸钾或醋酸钠0～150mM、dATP 1～5mM、dNTPs 150～600nM、DTT 1～12mM。

4.用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，其包含权利要求1所述的gRNA；

可选地，其还包含所述靶核酸的扩增组合产品、Cas12a核酸酶和/或具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶、单链DNA探针、阳性对照和用于CRISPR检测体系的缓冲液中的至少一种；

可选地，所述靶核酸的扩增组合产品用于执行如下任一项所述的方法：

重组酶聚合酶扩增技术、PCR扩增、NASBA等温扩增、环介导等温扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增和切口酶扩增反应；

可选地，所述靶核酸的扩增组合产品为权利要求2所述的引物，或权利要求3所述的扩增组合产品；

可选地，所述Cas12a核酸酶选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a中的至少一种；

可选地，所述与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO：9所示；

可选地，所述具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶为Cas12b核酸酶；

可选地，所述Cas12b核酸酶选自AacCas12b、Aac2Cas12b、AkCas12b、AmCas12b、AhCas12b和AcCas12b中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述单链DNA探针的5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。