[发明专利]微流控芯片技术检测对虾虹彩病毒的方法

说明书

本发明提供一种微流控芯片技术检测对虾虹彩病毒的方法，包括以下步骤：(1)样品的采集和DNA提取；(2)利用LAMP试剂盒进行LAMP反应；(3)微流控芯片技术检测所述(2)中LAMP反应结果。根据本发明的方法，能够快速检测对虾虹彩病毒。

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术检测对虾虹彩病毒的方法。

背景技术

虹彩病毒(Iridescent virus)属虹彩病毒科，是一类二十面体有囊膜双链DNA病毒，大小 为130-200nm。虹彩病毒可寄生于无脊椎动物和变温脊椎动物。虹彩病毒科现有5个病毒属： 其中虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)寄生于无脊椎动物，蛙病毒属 (Ranavirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)寄生于鱼类、 爬行类和两栖类等多种变温脊椎动物。

虹彩病毒是水产动物病毒中危害极为严重的病毒。感染对虾的虹彩病毒最早于由Lightner 和Redman发现于马达加斯加的樱虾中；2016年我国学者从养殖红鳌鳌虾(Cheraxquadricarinatus)中分离到新的虹彩病毒，命名为红鳌鳌虾虹彩病毒(Cheraxquadricarinatus iridovirus，CQIV)；2017年黄海水产研究所科研人员在浙江严重死亡的南美白对虾发现对虾虹 彩病毒，命名为虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescentvirus，SHIV)。根据全基因组序 列比对结果，CQIV和SHIV是同一病毒的不同分离株，两者均不属于虹彩病毒科下已建立的 5个属，可能是一种新的虹彩病毒属，鉴于该病毒可同时感染对虾科的南美白对虾等、拟对虾 科的红螯螯虾和螯虾科的克氏螯虾等种类，该病毒现命名为十足目虹彩病毒(Decapoda iridovirus)。

对虾虹彩病毒感染对虾后，可出现造血组织细胞和肝胰腺血窦、鳃丝等组织内的血细胞出 现核固缩，细胞内可见带嗜碱性细胞质包涵体。病毒感染后对虾空肠空胃、肝胰腺发白、软壳、 体色变红，濒死个体失去游动能力，沉入池塘底部而死；发病严重时，病虾可大批游至池边或 大量在池中漫游，并发生大量死亡，死亡率达50％以上。

目前对虾虹彩病毒主要通过PCR(聚合酶链式反应)技术和LAMP(环介导等温核酸扩 增)检测。PCR技术对检测设备和操作环境有较高要求、操作较为繁琐，反应只需1对引物， 易受干扰，特异性不足；LAMP技术针对靶基因设计4对反应引物，检测准确度和灵敏度更 高，但LAMP技术是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。

微流控芯片(Microfluidics)是一种基于微流体界面精确操作的技术，是临床检测前沿最重 要的检测和分析技术。通过在10-100微米通道内进行微量流体的操控、处理和反应，达到分 子检测的目的。该方法制作成本低、设备小型化、高通量、可同时检测多种样本、检测反应的 试剂消耗微量化、分析速度快、灵敏度高，具有操作简单、自动化、集成化等特点。采用微流 控芯片可实现对待测标本多种致病核酸的高通量快速检测，对于基于分子生物学的快速诊断发 展和重大疫病的快速微量检测和疾病源头的阻断具有重大意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供对虾虹彩病毒检测用引物组。该引物组特异性好灵敏度高且稳 定性高，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的前期检测，为疾病防控提供有效参考。该引物组序列 组成如下：

P1:5’-TGTTAGATGGGCAGTCATG-3’

P2:5’-GCATCCTTGATTGCTGGA-3’

P3:5’-ACGAATCGTTTCCCGTGAGACAAATGCTGACGAAATCATCA-3’

P4:5’-TGGGCTCGAGATTTGTTCCAACGCTTGTTGCAAATCATGTGTA-3’。