[发明专利]一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术

权利要求书

1.一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：患者体液依次经取样、样本前处理、CTC富集分离于微孔滤膜上、固定细胞、细胞银染和免疫荧光原位检测步骤，从核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否是肿瘤细胞，最后通过组织器官特异性蛋白标志物的荧光免疫检测，确定血液中CTC的器官组织来源。

2.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述固定细胞步骤和细胞银染步骤之间还有微孔膜的前处理步骤。

3.根据权利要求2所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述微孔膜的前处理为：用0.01N HCl处理3-5min，水洗后用0.05％Triton X-100/PBS处理3-5min，再水洗。

4.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述细胞银染步骤与免疫荧光原位检测步骤之间还设有银染后的再固定步骤及Triton处理步骤，银染后的再固定步骤为用醋酸溶液固定处理。

5.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述微孔膜为圆形或锥形微孔膜，直径0.5-1cm，微孔直径8或10微米。

6.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述细胞固定步骤为：用1ml固定液加入细胞过滤器，固定至少3-5min，再用PBS洗二次，将微孔膜从细胞过滤器中取出，移至12或24孔板中，PBS洗一次；所述固定液：90％酒精，5％of 1x PBS及5％乙酸。

7.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述细胞原位银染步骤为：在微孔膜上加入150微升的20％硝酸银，然后加入150微升2％明胶含2％甲酸，在室温20℃，约反应30-45min,避光；反应完毕，水洗2-3次，最后用10％乙酸处理3-5min，水洗2次。

8.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述免疫荧光检测步骤为：多聚甲醛的固定:用4％PFA/PBS液固定5-10min，PBS洗2次，然后0.1％Triton X-100处理3-5min。

9.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：应用于癌症患者外周血循肿瘤细胞、血源性恶性细胞以及实体瘤组织切片的形态检测，还包括其它体液，如淋巴液，尿液，腹水及脑脊液的检测。

10.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：不依赖组织活检样本，应用非侵入的方法，用于肿瘤高危人群通过检测外周血CTC，进行肿瘤早期筛查；确诊肿瘤的患者的疗法评估及术后复发监控的CTC检测。