[发明专利]一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法

说明书

本发明公开了一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法，属于植物组织培养领域。本发明油茶愈伤悬浮培养的方法，以材料数量巨大的茎段作为外植体，将诱导得到的致密愈伤组织在含NAA、2,4‑D、6‑BA的培养基上继代培养得到了容易建立悬浮细胞系的疏松颗粒状愈伤组织；该方法解决了现有技术诱导的油茶茎段愈伤组织较为致密、不适合进行悬浮细胞培养的问题。本发明油茶原生质体分离的方法，将油茶愈伤原生质体悬浮于密度较大的蔗糖溶液中，通过离心使密度较大的碎片等杂质下沉、油茶原生质体上浮，从而实现其分离纯化；该方法解决了油茶愈伤原生质体无法通过离心收集纯化的问题，其纯化效率高，获得的原生质体清晰可见、纯度高。

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，特别是涉及一种油茶愈伤组织悬浮培养及原生质体分离的方 法。

背景技术

油茶为我国重要的木本油料树种，有1000多年的栽培历史，主要分布在长江流域及其以 南地区，在维护国家粮油安全、发展农村经济和改善生态环境中发挥着重要作用。油茶有较 好的经济价值，其种仁提取的茶油营养价值极高，富含不饱和脂肪酸、维生素，而种仁提取 油脂之后剩下的茶粕，其提取物中包含茶皂苷、黄酮、单宁等生物活性成分，具有抗炎、抗 氧化、抗菌等功能。

但是，当前我国油茶产业发展面临很多问题：(1)油茶品种良莠不齐，导致产量低；(2) 缺乏对油茶主要病害如炭疽病的抗性品种；(3)栽培管理水平粗放。这就要求在加强栽培管 理水平的同时，培育出更加高产、优质、抗病、含油率高、适应性强的新品种。良种是油茶 产业发展的有力保障，而高效的育种方法是品种选育的关键。目前油茶育种方法主要是优良 无性系选育与杂交育种。尽管这些传统育种手段取得了一定的成绩，但由于油茶童期长且基 因组高度杂合，导致传统油茶育种方法的效率都不高。而现代生物技术手段的应用，将有助 于突破传统育种方法的局限。近年来，国内多个单位相继开展了油茶生物技术研究，在油茶 组织培养、转基因育种等方面都取得了一定的进展，而油茶原生质体分离和细胞融合研究还 未见报道。

细胞融合又称为原生质体融合、体细胞杂交，是指不同来源的原生质体不经过有性杂交， 在一定外界条件诱导下融合并再生杂种植株的过程。细胞融合能有效克服有性杂交不亲和以 及远缘杂交障碍等困难，近年来，细胞融合在柑橘、马铃薯等植物品种改良和创造中发挥了 重要作用，取得一系列重大进展与突破。而原生质体的成功制备是细胞融合技术的关键所在。 原生质体是指去除细胞壁以后植物细胞剩下的具有活力的、被质膜包围的部分，在体细胞融 合培育新种质、细胞壁再生机理、转基因植物创制等科学研究中具有重要作用。

选择合适的外植体是高效分离原生质体的基础，常用的外植体有叶片、愈伤组织、悬浮 细胞系等。其中，通过愈伤组织悬浮培养获得的悬浮细胞系具有来源统一、遗传背景一致、 细胞团细胞数量少、结构疏松等特点，其生长条件容易控制，生理状态基本相同，发生各种 反应更为迅速一致，具有较好的细胞全能性，因此悬浮细胞系是用于原生质体分离、培养的 理想材料。

目前油茶基础研究薄弱，油茶原生质体的制备工作虽有少量报道，但进展缓慢、技术远 不够成熟。一般制备原生质体的方法有机械法和酶法。申请号201610559094.5，专利名称为 “一种油茶原生质体的制备和纯化方法”中，公开了一种油茶原生质体的制备和纯化方法， 发明人采用机械法分离油茶叶片原生质体，产量为5.1×10⁵个/g·FW，但这样的产量相比于其 他植物用酶解法分离原生质体的产量而言很低。而酶解法操作简单，在合适酶解条件下可迅 速获得大量高质量的原生质体，广泛应用于原生质体的培养、融合和基因转化等原生质体下 游实验。如2011年白姗姗等用酶解法处理新疆杨愈伤组织可获得8.5×10⁶个/g·FW的原生质 体产量，活力达83.6％；2012年羿德磊等用酶解法处理桑树胚性悬浮培养细胞可获得7.8×10⁶个/g的原生质体产量，原生质体活力达91.4％。相比机械法而言，酶解法操作简单，获得的 细胞数目多，目前植物原生质体分离、细胞融合等研究大多数均采用酶解法制备原生质体。 而油茶愈伤组织悬浮培养、原生质体分离的研究还没有报道。

发明内容