[发明专利]一种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株

说明书

本发明提供了一种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株，通过下述方法制备而成：一个培养人源三阴性乳腺癌细胞MDA‑MB‑231的步骤；扩增含有红色荧光蛋白RFP的慢病毒载体，制备含有红色荧光标记的MDA‑MB‑231细胞；将RFP‑MDA‑MB‑231细胞移植到裸鼠第四对乳腺脂肪垫位置，生长成瘤；4‑6周后取后肢胫骨，用缓冲溶液冲取骨髓，再采用胶原酶消化，获得骨髓来源单细胞，体外培养扩增，流式细胞技术分选红色荧光细胞；通过裸鼠体内成瘤筛选，得到红色荧光标记的MDA‑MB‑231人三阴性乳腺癌骨转移细胞株。本发明具有骨转移特征，并且有荧光蛋白标记，实现了细胞在体内和体外的可视化、可示踪。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种细胞株，具体来说是一种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株。

背景技术

本世纪以来，全球乳腺癌发病率快速增长，成为城市女性的第一杀手。尽管乳腺癌早期诊断以及手术技术和放化疗水平的提高降低了乳腺癌死亡率，但恶性乳腺癌伴随肺、骨、脑等器官转移的致死率仍居高不下。据统计，未治愈的乳腺癌约70％会出现肺转移，约60％会出现骨转移和肝转移，约15％会出现脑转移。

尤其是三阴性乳腺癌约占乳腺癌的15％，恶性程度极高，易侵袭、易转移。因缺乏雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体-2(human epithelial growth factor receptor,HER2)等治疗靶点，一旦发生扩散和转移，难治愈且预后差。因此，阻止恶性乳腺癌扩散、转移，是从根本上解决恶性乳腺癌的高致死率的关键点。

MDA-MB-231细胞株是经典的、被全球医学科学家广泛认同并使用的三阴性乳腺癌细胞。MDA-MB-231细胞恶性程度高，移植小鼠后易成瘤，肿瘤生长速度快，而且容易转移到肺、骨等器官。

并非所有三阴性乳腺癌细胞都能够发生骨转移。建立具有高骨转移能力的三阴性乳腺癌细胞，必将有助于鉴定骨转移乳腺癌细胞亚群的基因表达特征，更有助于科学家寻找乳腺癌骨转移的治疗靶点和干预措施。这是本发明的初衷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株，所述的这种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株要解决现有技术中的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株不能可视化和可示踪的技术问题。

本发明提供了一种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株，通过下述的方法制备而成：

(1)一个培养人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的步骤；

(2)扩增含有红色荧光蛋白RFP的慢病毒载体，利用慢病毒转染细胞的方法，转染MDA-MB-231细胞，制备含有红色荧光标记的MDA-MB-231细胞；

(3)通过流式细胞仪分选，获得红色荧光RFP-MDA-MB-231细胞；

(4)将RFP-MDA-MB-231细胞移植到裸鼠第四对乳腺脂肪垫位置，然后进行哺育4-6周成瘤；

(5)乳腺肿瘤直径达到0.8-1.2cm时，处死裸鼠，解剖，取后肢胫骨，无菌环境下，用PH7.4的1x PBS缓冲溶液冲取骨髓，再采用胶原酶消化，获得骨髓来源单细胞，体外培养扩增；

(6)利用流式细胞分析仪，检测并分选从乳腺肿瘤转移到骨的红色荧光乳腺癌细胞，体外培养扩增，作为P1代乳腺癌骨转移细胞；

(7)扩增P1代乳腺癌骨转移细胞，移植裸鼠，重复上述第4-第6步，获得P2代乳腺癌骨转移细胞；

(8)扩增P2代乳腺癌骨转移细胞，移植裸鼠，重复上述第4-第6步，获得P3代乳腺癌骨转移细胞；

(9)通过上述三轮的裸鼠体内成瘤筛选，得到红色荧光标记的MDA-MB-231人三阴性乳腺癌骨转移细胞株。