[发明专利]二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法

权利要求书

1.二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建两端含接头序列的片段，该片段为L1-A-L2，其中，L1、L2为接头，A为DNA片段；

(2)检测获取步骤(1)中构建的L1-A-L2的拷贝数；

(3)以L1、L2为接头对A片段进行文库构建，文库构建完成后，对文库构建的产物进行纯化回收得到文库a；

(4)以L1-A-L2为标准品对文库a进行绝对定量，检测获取文库a中总A片段的分子个数n以及文库a中L1-A-L2的分子个数m，基于检测获取的n及m计算得到文库构建中接头的连接效率。

2.根据权利要求1所述的二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，步骤(1)中两端含接头序列的片段为人工合成的片段。

3.根据权利要求1所述的二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，步骤(1)中两端含接头序列的片段的构建过程为：通过PCR扩增获得A片段，以A片段为模板，以L1、L2为接头进行二代测序文库构建，接头连接完成后，以与接头L1、L2对应的引物为引物，以接头连接完成后的产物为模板进行PCR扩增。

4.根据权利要求3所述的二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，在步骤(1)构建两端含接头序列的片段的过程中，接头连接完成后，以与接头L1、L2对应的引物为引物，以接头连接完成后的产物为模板进行PCR扩增，PCR扩增至两端含接头序列的片段的占比超过99.999％。

5.根据权利要求3所述的二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，在通过PCR扩增获得A片段的过程中，模板为人类基因组，上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求2或3所述的二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，A片段的长度为200-500bp，且A片段的内部能够找到扩增效率为90-110％的扩增引物。

7.根据权利要求1所述的二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，步骤(2)中检测获取步骤(1)中构建的L1-A-L2的拷贝数的方法为：采用qubit测定核酸浓度的方法对L1-A-L2进行核酸浓度检测，将L1-A-L2的核酸浓度换算为拷贝数。

8.根据权利要求1所述的二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，步骤(4)中对文库a进行绝对定量的方法采用qPCR法。

9.根据权利要求8所述的二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，步骤(4)中以L1-A-L2为标准品采用qPCR法对文库a进行绝对定量的方法为：对标准品L1-A-L2进行连续梯度稀释，然后分别以与片段A对应的引物以及与接头L1、L2对应的引物为引物对标准品和文库a进行扩增，根据标准品的扩增结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算出文库a中总A片段的分子个数n以及文库a中L1-A-L2的分子个数m。

10.根据权利要求1或8所述的二代测序文库构建中接头连接效率的评估方法，其特征在于，步骤(4)中文库构建中接头的连接效率为文库a中两端连接有接头的分子个数占总A片段分子个数的百分比，即：文库构建中接头连接效率＝m/n×100％。