[发明专利]一种制备靶点特异性NK细胞的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种通过嵌合抗原受体(CAR)修饰制备靶点特异性NK细胞的方法及其应用，所述方法包括：(1)制备能耐受电转的活性增强型NK细胞；(2)应用编码肿瘤特异性嵌合抗原受体的mRNA，通过mRNA电转方法制备嵌合抗原受体修饰的NK细胞(CAR‑NK)。本发明将饲养细胞法和细胞因子刺激法相结合，显著提高了体外扩增后NK细胞的活性，进而提高了CAR转染效率。CAR修饰的NK细胞呈现肿瘤特异性的IFNγ分泌和肿瘤细胞杀伤能力。本发明提高了mRNA CAR‑NK细胞的制备效率，降低了CAR‑NK细胞的制备成本，在肿瘤免疫治疗、COVID‑19治疗、自身免疫病治疗、抗衰老领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于医学生物工程技术领域，涉及一种CAR-NK细胞的制备方法及其应用，尤其涉及一种活性增强型NK细胞的制备方法、活性增强型NK细胞用于CAR-NK制备方法及其制备得到的靶点特异性CAR-NK细胞。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是机体重要的免疫细胞，在外周血单个核细胞组成中占10％左右，是人体抗肿瘤、抗病原体感染的第一道防线。无需预先致敏或免疫接种，NK细胞便可以对肿瘤细胞表现出强烈的细胞毒活性，并产生许多细胞因子，激活适应性免疫系统。肿瘤经常以丢失肿瘤相关抗原和/或MHC分子作为逃逸T细胞免疫监控的手段。NK细胞可以以非MHC限制的方式裂解肿瘤细胞，而且无需肿瘤细胞表达相关抗原，因此，NK细胞被认为是过继性癌症免疫治疗的理想选择。在临床上，NK细胞的免疫治疗已被推荐用于治疗改善血液恶性肿瘤和实体瘤。Miller等人率先开展了NK细胞治疗癌症的临床研究，并取得了不错的疗效。NK细胞还在机体抗病毒免疫反应中也发挥着至关重要的作用，它既能直接杀伤病毒感染细胞，又具有强大的免疫调节功能，在新冠肺炎治疗中具有较大潜力。不仅如此，NK细胞可以还直接清除衰老细胞，同时活化吞噬细胞，增加它对衰老细胞的清理能力，从而达到延缓衰老、保持年轻态的目的。

目前，用于NK过继性细胞免疫疗法需要很高的细胞剂量和多次回输，而NK细胞免疫治疗的一个阻碍是难以生产大量功能完全的NK细胞，同时缺少体外扩增NK细胞的标准方法。与采用OKT3抗体便可激活并扩增T细胞相比，NK细胞对于类似刺激的反应较为温和、无法持续增殖。因此，为了克服这个障碍，研究人员正在开发一些新的方法来获得更多、更纯的NK细胞。