[发明专利]一种PCR随机引物和使用其构建靶向测序文库的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PCR随机引物和使用其构建靶向测序文库的方法。所述PCR随机引物从5’端到3’端依次包括成环互补序列、通用序列、UMI序列、UMI定位点和随机序列，其中，所述成环互补序列与所述通用序列中的部分序列反向互补。本发明的PCR随机引物在5’端引入成环互补序列，从而避免引物中随机序列的核苷酸与通用序列形成二聚体，充分暴露随机序列来提高与模板退火的效率；并且，本发明使用该PCR随机引物构建的文库具有在靶率高、均一性好和平均转化效率高等优势。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PCR随机引物和使用其构建靶向测序文库的方法。

背景技术

下一代测序(Next generation sequencing，NGS)也称为深度测序或大规模平行测序，可同时对数百万小片段进行测序。NGS已广泛应用于众多领域，其中最常用的是基因组DNA变异分析和RNA表达分析。这些分析应用可扩展到整个基因组和整个外显子组，还可专门测序特定区域和基因组合。

NGS测序前，有几种方法可以富集目标区域，最常用的两种方法是：1)基于探针捕获，通过设计与靶DNA序列互补的核酸探针来捕获靶DNA；这类方法因为需要合成探针，所以成本高，实验步骤冗长。2)基于多重PCR，通过设计靶DNA特异性的DNA引物进行PCR扩增来富集靶DNA；相比于基于探针捕获的方法，这类方法成本较低，步骤简短。

NGS和靶向序列捕获技术的进步使其可用于测序异质混合物中的低频突变。然而，PCR和测序方法的系统误差使NGS的进一步发展受到了限制。文库制备、靶向序列捕获和测序均采用DNA聚合酶以及扩增步骤，这些过程会引入偏差，包括重复、相应的不均匀扩增以及因聚合酶误差导致的假象，这种误差会引入原始样品中不存在的序列变化。为了对扩增和测序过程中出现的随机错误进行纠错，使用上述方法建库的过程中可以对每个模板分子加上独特的分子标记(UMI)。测序后具有同样分子标记且对比到基因组同一位置的读序(reads)可归为一组，并视为来源于同一个模板分子。由于扩增和测序错误是随机发生的，同组中如果有少于一半的读序中存在序列与其它读序不同的序列，该序列可视为扩增或测序错误，忽略不计，从而达到纠错的效果。

基于多重PCR的二代测序靶向技术的建库方法可以分成2种：1)使用成对的特异性引物进行常规PCR扩增对靶DNA区域进行捕获和富集；其中UMI可以包含在引物中，在前2个PCR循环中被整合至扩增子。2)首先对DNA片段用链接酶加上通用接头，其中UMI可包含在接头内，然后使用特异性引物和通用引物进行靶DNA富集。在上述基于多重PCR的建库方法中。方法1)需要至少一对引物来富集一个靶区域。引物设计是有条件限制的，比如说在很难在序列复杂度低的区域进行引物设计。这样很多时候成对引物跨度的区域会比较大。如果起始DNA片段小于引物跨越的长度，靶区域将得不到扩增。这在分子诊断中可能会造成灵敏度降低和假阴性。方法2)使用单端特异性引物，避免了使用双端引物时，短模板不能被富集的情形。但是要使用链接酶加上包含通用序列的接头。连接酶链接的效率一般在30％左右，意味着只有30％的起始DNA能被加上接头，转化为测序文库，损失剩下的70％。同样地，这在分子诊断中也会造成灵敏度降低和假阴性。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明提供了一种PCR随机引物和使用其构建靶向测序文库的方法。

本发明所采用的技术方案如下文所述。

本发明的第一方面涉及一种PCR随机引物，所述PCR随机引物从5’端到3’端依次包括成环互补序列、通用序列、UMI序列、UMI定位点和随机序列，其中，所述成环互补序列与所述通用序列中的部分序列反向互补。

根据本发明的一些实施方式，所述PCR随机引物从5’端到3’端依次由成环互补序列、通用序列、UMI序列、UMI定位点和随机序列组成。

根据本发明的一些实施方式，所述成环互补序列与所述通用序列中连接UMI序列端的部分序列反向互补。