[发明专利]快速标记的N-聚糖的液相色谱校准方法

说明书

本发明提供了用于制备快速标记的葡聚糖梯和用于液相色谱的其他校准物的方法。所述方法包括两步法，所述两步法包括提供还原性聚糖并且将其与具有伯胺的化合物反应以产生中间化合物的还原胺化步骤。然后用快速加标签试剂对所述中间化合物快速加标签以产生所述快速标记的葡聚糖梯。

本申请是以下申请的分案申请：申请日2015年11月12日，申请号201580072776.7，发明名称“快速标记的N-聚糖的液相色谱校准方法”。

相关申请的交叉引用

无。

背景技术

亲水相互作用色谱(“HILIC”)分离与UPLC平台的荧光检测联用，可用于拆分复杂的N-连接聚糖群，这是因为其能够在单次色谱运行中分离中性聚糖和带电荷聚糖二者。由于聚糖的异质性、异构化和端基异构性，要阐明复杂的N-联聚糖结构可能是一个重大的分析挑战。葡聚糖梯(dextran ladder)可用于校准对聚糖的亲水相互作用色谱(“HILIC”)分离，并将峰保留时间转化成葡萄糖单元(“GU”)值。每个单独的聚糖结构具有与其键和其组成单糖直接相关的GU值。由于对于给定的聚糖，每个聚糖结构组分均以特定的方式贡献GU值，所以GU值可用于预测结构。

因此，通过参考分离校准物，例如基于葡聚糖梯的校准物，聚糖的洗脱时间可用葡萄糖单元表示。葡聚糖梯可用于校准液相色谱(“LC”)的运行，防止其因不同时日或不同系统而变化。GU值可通过将五阶多项式分布曲线或三次样条拟合曲线拟合到葡聚糖梯的保留时间来计算。然后，使用该曲线，可根据在测试样品中观察到的保留时间来分配GU值。只要柱间的标准偏差小于0.3，N-聚糖的GU值便为可重现的。这就允许与在一段时间内从一系列仪器中收集到的数据库值进行直接比较。有了GU值，就能够查询以GU值储存的聚糖的数据库，从而有助于阐明聚糖群中存在的潜在聚糖结构。

此外，甚至在比较不同的加标签方法时，可以看出HILIC分离将标记的N-聚糖拆分成非常相似的特征谱。要产生适用于用快速加标签试剂快速标记的聚糖的葡聚糖梯并不是一项简单的任务。与通过N-糖基化蛋白的酶促去糖基化释放的N-糖基胺不同，葡聚糖是一种含还原醛末端的糖。因此，与N-糖基胺不同，葡聚糖不能用靶向胺亲核试剂的快速加标签试剂来修饰。因为葡聚糖不包含合适的亲核物质，因此不能被快速标记。因此，需要使用与快速标记的N-聚糖具有相同的光学和/或其他物理化学性质的标准物来校准液相色谱过程的方法。

发明内容

本文提供了制备快速标记的葡聚糖梯和其他可用于液相色谱的校准物的方法。该方法包括以下步骤：提供具有醛基的还原性聚糖，并将该还原性聚糖与具有伯胺的化合物反应以产生中间化合物。用快速加标签试剂快速标记该中间化合物以产生快速标记的葡聚糖梯，该葡聚糖梯与用快速加标签试剂对N-聚糖快速加标签所产生的快速标记的N-聚糖具有基本上相同的光学性质。本文还提供了具有以下结构式的校准物：

其中R为葡萄糖单元或单糖单元。本文提供的方法适用于对含醛基的化合物快速加标签或加双标签。

附图说明

图1示出了用于制备快速标记的N-聚糖的工作流程的实施方案。

图2示出了用快速加标签试剂标记的快速标记的N-聚糖的荧光发射光谱，其具有的优化激发波长为265nm，优化发射波长为425nm。

图3示出了用快速加标签试剂的类似物仅通过还原胺化标记的葡聚糖梯的荧光发射光谱，其荧光特性发生了偏移，具有的优化激发波长为370nm，优化发射波长为480nm。

图4A和图4B示出了用本文提供的方法产生的快速标记的葡聚糖梯的荧光特性。

图5A、图5B和图5C示出了通过本文提供的方法产生的快速标记的乙醇胺葡聚糖梯的代表性HILIC荧光色谱图。

图6A、图6B和图6C示出了实施例3的每批次快速标记的葡聚糖梯的对应基峰离子(“BPI”)色谱图。