[发明专利]一种测定血清中茚达特罗格隆溴铵浓度的方法

权利要求书

1.一种测定血清中茚达特罗格隆溴铵浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：储备液配制，分别精密称量茚达特罗对照品2份，用甲醇溶解摇匀、配制成浓度20.00μg/mL的茚达特罗储备液，即储备液茚达特罗-STD-Stock，茚达特罗-QC-Stock；分别精密称量格隆溴铵对照品2份，用甲醇溶解摇匀、配制成浓度20.00μg/mL的格隆溴铵储备液，即储备液格隆溴铵-STD-Stock，格隆溴铵-QC-Stock；

步骤二：工作液的配制，标准曲线工作液以茚达特罗-STD-Stock和格隆溴铵-STD-Stock为起始溶液，以甲醇：水(50：50，v：v)溶液为稀释溶剂逐级稀释得到茚达特罗和格隆溴铵的各级标准曲线工作液；质控工作液以茚达特罗-QC-Stock和格隆溴铵-QC-Stock为起始溶液，以甲醇：水(50：50，v：v)溶液为稀释溶剂逐级稀释得到茚达特罗和格隆溴铵的各级质控工作液；

步骤三：标准曲线和质控样本的配制，吸取95％体积的人空白血清，加入5％体积步骤二提出浓度的工作液，得到曲线样本和质控样本；

步骤四：内标工作液的配制，用甲醇溶解茚达特罗-d3和格隆溴铵-d3对照品，用50％甲醇作为稀释液稀释得到内标工作液浓度分别为8.000ng/mL、2.000ng/mL；

步骤五：茚达特罗样品预处理；取血清样本150.0mL于96孔板中，加入50.00mL内标工作液(茚达特罗-d3，8.000ng/mL)，加入沉淀剂乙腈450.0mL，涡旋10-20min，高速离心(4000-5000rpm)15-25min，取上清400.0mL于另一96深孔板中，进行LC-MS/MS分析，进样体5.000mL；

步骤六：格隆溴铵样品预处理，取血清样本50.00mL于96孔板中，加入20.00mL内标工作液(格隆溴铵-d3，2.000ng/mL)，加入沉淀剂乙腈250.0mL，涡旋10-20min，高速离心(4000-5000rpm)15-25min，取上清150.0mL于另一加有150.0mL超纯水的96深孔板中，涡旋混匀5-10min，离心3-8min，进行LC-MS/MS分析，进样体10.00mL；

步骤七：方法验证，按照中国药典2015版《生物样品定量分析方法验证指导原则》的要求，对本方法进行了验证，验证内容包括选择性、标准曲线、定量下限、精密度和准确度、提取回收率、基质效应、稀释效应、残留效应、稳定性和样本容量。

2.根据权利要求1所述的一种测定血清中茚达特罗格隆溴铵浓度的方法，其特征在于：步骤六中，LC-MS/MS分析过程，LC-MS/MS系统由QTRAP 6500型三重四极杆串联质谱仪(ABSciex)、高压泵(LC-30AD)、在线脱气机(DGU-20A-5R)、自动进样器(SIL-30AC)以及柱温箱(CTO-20A)(日本岛津)组成。

3.根据权利要求1所述的一种测定血清中茚达特罗格隆溴铵浓度的方法，其特征在于：步骤一中，储备液的储存温度为4℃。