[发明专利]一种肝癌的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用

说明书

本发明公开了一种肝癌的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用，该标志物包括序列为SpecSeq1‑100所示蛋白中的至少一种。本发明基于高通量测序方法，只需要采取少量外周血，提取RNA，通过对样本的处理建立免疫图谱文库，再经过高通量测序和TCR数据分析，首先确定肝癌外周血中特征性TCR序列，然后将待测样本测试结果与该特征性TCR序列比对，从而确定是否患有肝癌。本发明能够同时比较巨大数量的肝癌特异性TCR序列，相比单独检测一种或几种标记物，具有更高的特异性和准确性，提高了诊断效率。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种肝癌的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用。

背景技术

据世界卫生组织2018年最新统计数据显示，肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在各类癌症发病占比中排名第一(4.7％)，在癌症死亡占比中排名第四(8.2％)。中国是肝癌大国，其发病率位列全国恶性肿瘤第四位，死亡率位列恶性肿瘤第二位。现有的肝癌治疗手段虽多，但病人的实际获益十分有限。国内一项大规模研究共纳入1330例肝细胞癌病人，术后5年生存率36.9％，复发率61.5％，即使是小肝癌5年复发率也高达43.5％。化疗、介入、消融、分子靶向药物等方法主要针对不能手术或术后复发转移的病人，但由于大多数肝癌本身对化疗药物的低敏感性，以及长期慢性肝病背景下肝脏功能的消耗和衰竭，大大限制了这些方法的可应用性和有效性。早诊断、早治疗，是提高肝癌治疗效果，改善患者预后，节约社会资源的迫切需求。

目前针对肝癌的诊断手段主要分为生物化学方法、分子生物学方法、细胞学方法和影像学方法四大类。

1、生物化学方法

通过酶联免疫检测(ELISA)等方法，检查患者组织样本(通常为血液、血清)中的肿瘤标志物。常见生物化学检测肿瘤标志物有：

甲胎蛋白(AFP)是最常用的肝癌肿瘤标志物，诊断敏感度为39％～65％，特异度为76％～94％。但其敏感度和特异度均不能令人满意，尤其在具有小肿块的肝癌早期阶段，80％的患者血清AFP并未见明显升高，因此在肿块直径＜3cm和＞3cm的肝癌患者中，AFP的检测敏感度分别为25％和52％。

甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)为肝癌细胞特有，因此常用AFP-L3与AFP的百分比作为肝癌早期诊断的标志物。AFP-L3在肝癌恶性程度评估、治疗效果和预后判定方面有着重要的意义，尤其对低水平AFP肝癌或小肝癌的早期诊断意义较大。

高尔基体蛋白73(GP73)在正常人的肝细胞中表达量极低或者不表达，而在肝癌患者血清中明显升高。肝炎和脂肪肝也可导致GP73水平升高，不过其升高程度远低于肝癌患者。低水平AFP小肝癌患者中，GP73检测敏感度和特异度分别为72.0％和94.0％。因此GP73是一个较好的小肝癌的辅助诊断标志物。

磷脂酰基醇蛋白聚糖3(GPC-3)是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白，在正常人肝脏中并不表达，在肝癌患者中明显高于良性肝脏疾病患者，因此其有助于肝癌的早期诊断和良恶性肝肿瘤的鉴别诊断。目前，GPC-3的敏感度和特异度分别为36％～65％、65％～100％，且在小肝癌的检测方面敏感度优于AFP。

骨桥蛋白(OPN)是一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，存在于人体多种组织细胞中，但在恶性转化的上皮细胞中表达量特别高。肝癌患者血清OPN水平明显高于良性慢性肝病患者。OPN用于诊断肝癌的特异度为26％，敏感度为92.5％。

CD166是免疫群蛋白超级家族的细胞表面构件，与肝癌疾病进展情况、疾病预后有一定联系，因此作为一种血清标志物，用于肝癌的诊断和复发监测，灵敏度和特异性高于AFP。

转化生长因子β1(TGFβ1)在肝癌患者血清中的水平明显高于正常对照组和肝脏良性疾病对照组。但由于TGFβ1在肝外肿瘤、伤口愈合、血管再生和纤维化中均会升高，从而导致其特异度降低。