[发明专利]检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型方法及引物

说明书

本发明公开了检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型方法及引物，具体涉及分子生物学技术领域，引物序列如下：HRM上游引物:ATATGGAAAGCACCTCATGA；HRM下游引物:AAACAGCAAGTCAACATATATACT，本发明操作简单，检测速度快，全部操作过程只需要约2.5小时，大大缩短了检测时间。该方法具有费用低、敏感性高、特异性高和重复性好等优点，可以准确、快速地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于快速检测红细胞Rh血型系统 RHD*1227A等位基因HRM基因分型方法及引物。

背景技术

Rh血型系统(ISBT004)是最复杂的人类血型系统之一，目前已发现超过 50种血型抗原，其中D抗原免疫原性最强，临床上可引起溶血性输血反应和严重的新生儿溶血病，具有重要的临床意义。D抗原是由RHD基因编码，根据红细胞膜上D抗原表达情况，可将D抗原血型分为D阳性、D阴性、D变异型和D放散型(D-elute,DEL)。

Rh血型系统DEL型是日本学者Okobo于1984年在初筛为RhD阴性献血者中发现的一种RhD抗原表型，并逐渐受到人们的重视。DEL型个体红细胞膜上D抗原数量非常少，常规的血清学检测(盐水法和间接抗球蛋白试验)结果一般为阴性，其血型抗原表型只有通过敏感的吸收放散试验才能鉴定出来。由于吸收放散试验存在消耗抗体多、操作过程费时费力及对操作技能要求高等问题，所以吸收放散试验并未常规应用于临床检测。这些原因造成DEL血型个体一直未被鉴定出来，长期被作为RhD阴性个体对待。因此，常规检测结果为RhD阴性的个体其实可进一步分为RhD“真阴性”(红细胞表面不含D抗原，基因型为 d/d或其它RHD无效等位基因，不含RHD*1227A等位基因)和RhD“假阴性”(即 DEL血型，红细胞表面含少量D抗原，常规血清学方法检测不出来，其表型只能通过吸收放散试验才能检测出来)。超过95％的中国DEL型个体含纯合的 RHD*1227A等位基因(RHD*1227A/RHD*1227A基因型)或者杂合的RHD*1227A等位基因(RHD*1227A/d基因型)。

与白种人和黑种人中DEL型的罕见分布不同，在包括中国人群在内的东亚和东南亚人群中初筛常规检测结果为RhD阴性的个体中，有20-30％为DEL血型。并且超过95％的中国DEL型个体的分子遗传基础是RHD*1227A等位基因(GenBank 序列号AF390110；含1227GA突变，编号为rs549616139)。近年来研究发现，在中国汉族携带RHD*1227A等位基因的DEL人群中，其红细胞膜具有完整的D 抗原表位，因此这些DEL型个体可能不会被D抗原免疫而产生同种免疫反应，即输注RhD阳性血或孕有RhD阳性胎儿可能不会产生抗-D。进一步临床研究也支持这一推测：104例产生抗-D的孕妇中没有一例是携带RHD*1227A等位基因的DEL型个体，且44例携带RHD*1227A等位基因的DEL孕妇中没有一例产生抗 -D。到目前为止尚未有携带RHD*1227A等位基因的DEL型孕妇发生Rh新生儿溶血病的病例报道。因此，对常规血清学检测结果为RhD阴性的孕妇进行RHD*1227A 等位基因的准确鉴定，对于携带有RHD*1227A的DEL血型孕妇，可以减少孕期不必要的血型抗体的监测，也可以避免不必要的医疗干预来预防抗-D产生(主要措施是注射昂贵及来源困难的抗-D免疫球蛋白)。

目前DEL血型的血清学检测方法是吸收放散试验。吸收放散试验存在消耗抗体多、操作过程费时费力及对操作技能要求高等问题，不适用于临床大规模常规检测。

因此，发明用于快速检测红细胞Rh血型系统RHD*1227A等位基因HRM基因分型方法及引物很有必要。

发明内容

为此，本发明实施例提供用于快速检测红细胞Rh血型系统RHD*1227A等位基因HRM基因分型方法及引物，通过采用PCR扩增后HRM分析的方法进行基因水平上的检测，可以灵敏且高精度检测突变等位基因的有无，以解决背景技术中的问题。