[发明专利]经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用，通过对紫色杆菌素生物合成基因簇的核糖体结合位点进行定点突变和密码子缺失突变改造，促进紫色杆菌素合成蛋白的有效翻译，获得生产潜力显著提高的改造基因簇；通过将上述改造基因簇或者含有改造基因簇的重组载体导入到宿主菌，获得了高产紫色杆菌素的工程菌；进一步对工程菌的发酵条件进行了优化并提供紫色杆菌素的分离纯化方法。本发明构建的基因工程菌株不仅能够显著提高紫色杆菌素的产量，且与常规的紫色杆菌素20℃或25℃低温发酵不同，在25‑37℃的温度条件下均可高效生产紫色杆菌素代谢产物，解决了发酵过程中的降温成本高的问题，适用于规模化生产。

技术领域

本发明涉及经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

紫色杆菌素(violacein)是微生物产生的一种代谢产物，属于吲哚衍生物，由两个色氨酸分子氧化缩合而成，具有抗肿瘤、抗病毒、抗金黄色葡萄球菌感染、抗氧化、抗疟疾、调节免疫等良好的生物活性，同时由于其本身的蓝紫色特征，可以作为一种天然色素。因此，紫色杆菌素在医药、保健、化妆品、食品添加剂、杀虫剂、纺织品、玩具等广泛的工业市场中具有潜在的应用价值。

由于紫色杆菌素类化合物具有良好的应用潜力，人们对提高其在发酵液中的产量做了大量的工作。然而，由于原产菌存在低生产率和潜在条件致病性，当前主要将紫色杆菌素生物合成基因簇在实验室常见的模式菌株中进行异源表达,然后进行代谢工程和合成生物学的改造。在这些研究中，普遍采用了几种策略。第一种策略是，尝试不同的表达菌株，如E.coli,C.freundii,E.aerogenes,C.glutamicum。第二种策略是，优化色氨酸前体供应的中心代谢途径，包括色氨酸产生和调控基因的过表达、抑制和降解基因的敲除等。第三种策略是，针对紫色杆菌素合成基因簇进行改造，或者是过表达限速酶，或者是对紫色杆菌素的五个合成基因操纵子进行重新排序。虽然当前基因工程菌的发酵产量已经获得很大提高，但仍不能满足未来工业化生产中对成本的严格要求。为了进一步提高紫色杆菌素的产量，应尝试新的策略并加以应用。

发明内容

本发明的目的是从紫色杆菌素生物合成基因的有效翻译角度，通过对其合成基因相应的核糖体结合位点进行突变改造，提高紫色杆菌素合成基因簇的生产潜力，同时构建出一系列高产紫色杆菌素的基因工程菌株，用于生产应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇。这些经过遗传改造的基因簇是在SEQ ID NO：5所示的紫色杆菌素生物合成相关基因核苷酸序列基础上进行的突变。SEQ ID NO：5是来源于Chromobacterium violaceum(ATCC 12472)的紫色杆菌素生物合成相关基因的核苷酸序列，包含紫色杆菌素整个合成途径中涉及的5个酶相关的vioA，vioB，vioC，vioD，vioE基因。

具体的，所述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇如下：

1)vioBm：是将SEQ ID NO：5所示紫色杆菌素生物合成相关基因中vioB基因的天然核糖体结合位点序列(GGGAAA)被突变为(AAGGAG)；

2)vioCm：是将SEQ ID NO：5所示紫色杆菌素生物合成相关基因中vioC基因的起始密码子“ATG”与vioB基因的终止密码子“TGA”共用“A”碱基，该突变缩短了vioC天然核糖体结合位点“GAGAGG”与其起始密码子“ATG”的距离至4bp；

3)vioDm：是将SEQ ID NO：5所示紫色杆菌素生物合成相关基因中vioC基因3’端的密码子“GTC”发生删除突变，该突变缩短了vioD天然核糖体结合位点“AGGGAG”与其起始密码子“ATG”的距离至6bp；