[发明专利]一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用

说明书

本发明涉及一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用，包括以下步骤：1)原代肿瘤细胞培养与传代；2)将所述步骤1)得到的培养于培养皿中的原代肿瘤细胞进行X线照射，继续培养；3)将所述步骤2)得到的细胞与化疗药物共孵育，收集上清液，获得携载化疗药物的微泡。本发明还提供一种携带化疗药物的抗肿瘤微泡，由抗肿瘤微泡纯化浓缩得到。本发明提供的携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法制得的抗肿瘤微泡可用于制备抗肿瘤药物,可实现对肿瘤更高效的杀伤效应，拓展放疗与化疗的适应范围。

技术领域：

本发明涉及抗肿瘤技术领域，具体地，涉及一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用。

背景技术：

放疗导致的旁观者效应(radiation-induced bystander effect，RIBE)是指射线辐射细胞后，不仅会导致被照射细胞死亡，还会导致未收到辐射的周围细胞死亡。RIBE的主要原理是辐射细胞产生的微泡中含有高含量的ROS以及其它一些DAMP损伤分子，该微泡能够被周围肿瘤细胞高效摄取，导致肿瘤细胞的间接死亡。前期的研究揭示，单独注射肿瘤细胞放疗后产生的微泡能够有效治疗和延缓肿瘤的发生发展，证明了自体来源的肿瘤细胞微泡具有重要的临床应用价值。

化疗是临床常见的对中晚期肿瘤进行治疗的一种手段，但是最近的研究揭示，部分肿瘤会产生多药耐药性，其产生原理主要与肿瘤细胞受到刺激后高表达多药耐药相关蛋白相关，并且大大减低化疗药物对肿瘤细胞的在体毒性作用。更多研究专注于结合不同肿瘤治疗方式防止肿瘤细胞多药耐药性的产生，从而实现对在体肿瘤的有效杀伤以及减小对正常器官的损伤。专利号为ZL201910031298.5的专利通过使用放疗照射肿瘤细胞后，细胞将大量分泌富含ROS的微泡，将富含ROS的细胞微泡和免疫激活剂物理混合制成抗肿瘤疫苗，能产生较强的体外和淋巴结内DC激活效应，起到防止肿瘤复发的效果。但是这种方法制得的抗肿瘤疫苗只能防止已有肿瘤的复发，对于防止肿瘤细胞产生多药耐药性效果不佳。

发明内容：

(一)解决的技术问题：

本发明旨在提供一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用，将携载化疗药物的肿瘤细胞放疗后取得的微泡用于肿瘤治疗，可实现放疗一体化的有效治疗手段，解决现有技术存在局限性，在进行放疗后存在肿瘤细胞多药耐药性的问题。

(二)技术方案：

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法，包括以下步骤：

1)获得离体肿瘤细胞在培养皿中培养原代肿瘤细胞，进行增殖传代；

2)将由所述步骤1)得到的放于培养皿中的所述原代肿瘤细胞进行X线照射，继续进行培养；

3)将所述步骤2)得到的细胞与溶解于培养基中的化疗药物一同孵育一段时间，收集上清液进行超滤离心，得到的微泡即为含有化疗药物的抗肿瘤微泡；

4)将所述步骤3)得到的携载所述化疗药物的所述抗肿瘤微泡使用紫外分光光度计或者高效液相色谱进行鉴定，携带的所述化疗药物具有特异性的紫外光谱吸收特性或者能够在高效液相色谱中观察到化疗药物组分。

进一步地，步骤3)中所述离心包括依次进行的第一离心、第二离心、第三次离心，所述第一离心的转速为1000g，时间为10分钟；继续进行第二离心的转速为14000g，时间为2分钟，得上清；第三离心的转速为14000g，时间为60分钟，得沉淀即为携载化疗药物的所述抗肿瘤微泡。

进一步地，所述步骤2)的X线放射剂量为2-30Gy，X线能量为6MV；所述上清液收集时间为放疗后的第2-7天，所述化疗药物包括烷化剂、抗代谢类药物或抗生素。