[发明专利]人PIK3CA基因突变的数字PCR检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种人PIK3CA基因突变的数字PCR检测方法及应用。具体地，提供了优选的针对PIK3CA E545、E542和PIK3CA H1047所在序列的引物对、扩增方法、核酸探针以及检测体系，进一步还提供了用于检测PIK3CA基因突变的试剂盒。本发明通过优化的引物对和探针以及相应反应条件，从而可以对不同样本高灵敏度、强特异性地检测PIK3CA基因突变。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体地，涉及人PIK3CA基因突变的数字PCR检测方法及应用。

背景技术

PIK3CA是位于3号染色体上的原癌基因，共有20个外显子。PIK3CA突变约80％发生在螺旋区(Helical)和激酶区(Kinase)这两个热点区域，其中最常见的三个突变是外显子20上的H1047R，外显子9上的E542K和E545K。PIK3CA基因的突变不仅可以引起PI3Ks的催化活性增强，并且可促使细胞癌变。

PI3Ks作为EGFR下游信号分子被激活，可导致肿瘤细胞对EGFR-TKI药物的耐药，例如PIK3CA基因的突变可导致西妥昔单抗、帕尼单抗对转移性结直肠癌治疗的耐受，导致吉非替尼、厄洛替尼对非小细胞肺癌治疗耐受。PIK3CA突变对于乳腺癌个体化靶向药物曲妥珠单抗治疗无效，野生型治疗有效。KRAS、BRAF、PIK3CA任何一个或多个突变对结直肠癌个体化靶向药物西妥昔单抗、帕尼单抗治疗无效，全部为野生型治疗有效。

因此，检测PIK3CA基因突变可供医生在非小细胞肺癌患者中选择吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼等靶向药物治疗提供参考；在结直肠癌患者中使用西妥昔单抗和帕尼单抗等靶向药物治疗提供参考；以及在乳腺癌患者中选择曲妥珠单抗等靶向药物治疗提供参考。

然而，在实际检测结直肠癌患者的PIK3CA基因突变的过程中，仍然面临着检测样本质量等问题。尽管肿瘤组织和肿瘤细胞学样本是突变检测的最佳样本，但此类样本获取难度大。检测血浆中的游离核酸(Circulating free DNA,简称“cfDNA”),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfDNA的变化，进而监控病情变化。

然而，采用无细胞的核酸(如cfDNA)作为肿瘤患者中的生物标志物存在一定难度，尤其是应用cfDNA检测准确并特异地检测基因突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中的cfDNA含量因人而异，而且大部分情况都非常低,而其中肿瘤来源的游离核酸(Circulating tumor DNA,简称“ctDNA”)的质量更是参差不齐、含量高低不一。

不仅如此，cfDNA检测方法特异性有待提高。Douillard等人报道，使用血浆检测EGFR突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。

此外，目前虽然有一些基于cfDNA来检测PIK3CA基因突变的方法，但是这些方法的灵敏度和特异性尚难以令人满意。

因此，本领域迫切需要开发基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测PIK3CA基因突变的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测PIK3CA基因突变的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测基因突变的试剂，所述试剂选自下组：

(a)用于检测PIK3CA E545和/或E542突变的第一引物对，其中第一引物对包括SEQID No:1和2所示的引物；

(b)用于检测PIK3CA H1047突变的第二引物对，其中第二引物对包括SEQ ID No:7和8所示的引物；

(c)上述(a)和(b)的组合。