[发明专利]一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法

权利要求书

1.一种CircRNA作为肝癌肿瘤标志物的评价方法，其特征在于，所述CircRNA对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述CircRNA对应的核苷酸序列还可以为SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的评价方法，其特征在于，包括以下过程：

S1、取肝癌组织中的CD90posi细胞，进行原代及传代培养，得CD90posi细胞；

S2、提取步骤S1所得CD90posi细胞中的CircRNA，稀释成浓度为40～60μg/mL，得CircRNA稀释液；

S3、向步骤S2制得的CircRNA稀释液中加入与CircRNA亲和结合的荧光探针及促光亮剂，得肿瘤标志物；

S4、将步骤S3所得肿瘤标志物，加入肝癌组织细胞中，检测CD90posi细胞的数量，进行评价，即得。

4.如权利要求3所述的评价方法，其特征在于，步骤S1中的原代培养采用组织块培养，具体操作过程为：

(1)取肝癌组织，经体积分数为75％的乙醇消毒，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤3次，用弯头剪把胚胎尽量剪碎，每个组织块小于1mm³，得初步处理的组织块；

(2)将步骤(1)制得的初步处理的组织块用Hanks液洗涤2-5次，低速离心，去除上清液，然后向其中加入0.8～1.0％的双抗，混匀，得处理好的组织块；

(3)加入小牛血清600～800μL于组织块中，用弯头吸管将组织块逐个铺展于培养瓶中，将瓶子翻转倒置后在37℃下，置于培养箱内1-2h，待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来，从边角加入6-8mL培养基，使细胞接触到培养基，放培养箱内继续培养3-5小时，即得。

5.如权利要求4所述的评价方法，其特征在于，步骤(2)中的双抗由青霉素与链霉素按质量比3：5组成。

6.如权利要求4所述的评价方法，其特征在于，步骤(3)所得的培养基包括如下成分及其重量百分数：RPMI1640培养基95.9％～97.6％，芦荟提取物0.5％～0.8％，虎尾兰提取物0.3％～0.6％，穿心莲粉0.5～1.0％，I型胶原蛋白0.8～1.2％，弹性蛋白0.3％～0.5％。

7.如权利要求3所述的评价方法，其特征在于，步骤(1)所述的传代培养，包括以下步骤：

(1)倒掉培养细胞的旧培养基，用3-5mLHanks液洗去残留的旧培养基，向培养瓶中加入500～600μL胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，得培养细胞；

(2)向步骤(1)所得培养细胞中加入0.1～0.2mL的胎牛血清及原代培养的培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，向培养瓶中补加4～6mL的胎牛血清及培养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中，盖上瓶盖，适度拧紧后，将培养瓶置于CO₂培养箱中，于37℃培养，2天更换一次培养基，培养72h。

8.如权利要求7所述的评价方法，其特征在于，步骤(1)所述的胰酶的质量浓度为0.25％，所述培养瓶的规格为30cm×50cm的矩形，高度为30cm。

9.如权利要求3所述的评价方法，其特征在于，所述步骤S2中提取CD90posi细胞中的CircRNA采用ABIStepOne Plus试剂盒。

10.如权利要求3所述的评价方法，其特征在于，所述步骤S3中的亲和荧光探针为hsa-circ-0001727probe；所述促光亮剂的加入量为0.05～0.08g，由3,4-丙烯二氧噻吩、钛白粉按质量比1～3：7～10组成。