[发明专利]基于光子复位技术的全光学超分辨显微装置

说明书

本发明提供了一种基于光子复位技术的全光学超分辨显微装置，包括：照明系统、扫描系统、荧光激发收集系统，激发样品上的荧光信号；去扫描系统，样品反射的荧光信号通过同一光路返回后，出射扫描振镜的荧光光束与扫描系统入射扫描振镜的光束在同一直线上；再扫描系统，所述去扫描系统后的出射光束扩束，再一次导向扫描振镜，实现光子复位；成像系统，接收经再扫描处理后的光束，分别对样品的不同扫描位置成像。由于一个发射光子的真实位置是在激发焦点和探测点之间距离的一半处，本系统在去扫描和再扫描光路中设置二倍的光束扩束，利用光学方法将每一个检测到的光子重新复位到其相对应位置上，得到一个具有更高检测效率和分辨率的图像。

技术领域

基于光子复位技术的全光学超分辨显微装置属于光学显微测量领域，具体而言，涉及一种利用光子重新分配原理，借助全光学的手段实现高分辨率的显微成像装置。

背景技术

激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)因具有光学切片能力和高的成像对比度而在生物医学检测领域应用广泛。作为一种研究成熟的荧光显微镜，CLSM优秀的成像特性是通过使用具有较高动态范围的探测器和设置共焦探测针孔来实现的。在普通的CLSM中，每个扫描点的探测强度值通过积分探测器来记录，如光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管等；针孔与激发焦点位置同轴共轭，通过将检测到的光照强度赋给相应的激励扫描的位置，从而构造出相应的图像。此后，有研究表明，应用离轴针孔可以进一步提高分辨率。由于面阵探测器存在多个离轴像素点，且有研究表明样品上荧光发射光源的实际位置在激光的焦点和偏离光轴的探测点间的1/2处，在最终图像合成时，结合每个激发扫描位置拍摄到的针孔平面图像及其位置信息。借助面阵探测器和以上的光子复位算法可实现传统显微镜分辨率的提高。

遵循以上原理，有学者提出了图像扫描显微镜，即将激光扫描共聚焦显微镜中作为探测器的光电倍增管(PMT)替换为面阵探测器CCD，基于以上光子复位原理，在后续计算机图像处理中，对探测器的离轴像素点采集到的图像进行移位，即将探测图像移位至激光的焦点和偏离光轴的探测点间距离为一半的位置处，将面阵探测器上每个像素点探测到的光子重新分配到准确位置，对所有移位后的图像叠加后便可得到一个具有更高检测效率和分辨率的图像，最高可达到原始分辨率的两倍。除分辨率的提升外，图像扫描显微镜的设备简单，易于操作，可较好的兼容现有的激光扫描共聚焦显微镜。

由于在原始的图像扫描显微镜中，需要采集每一个像素点的图像，此外每张采集到的图像还需要相应的移位处理，这使得图像扫描显微镜的成像速度十分缓慢，有实验表明对微米级的小图像成像也需耗费数十分钟，后期的图像重建大大限制了其适用性，若能提升图像扫描显微镜的成像速度，将会极大的提升其在生物医学等领域的应用。

发明内容

本发明解决的问题是如何借助光学的手段，在图像扫描显微镜成像的同时完成光子复位的步骤，从而省去后续图像处理时间，一方面大大提升了成像的速度，另一方面也从源头消除了后续处理算法中人为因素而导致光子复位不精准的问题，同时仍保留其两倍分辨率提升的优势。

为解决以上问题，本发明提出一种基于光子复位技术的全光学超分辨显微装置，包括照明系统、扫描系统、荧光激发收集系统、去扫描系统、再扫描系统和成像系统，其中：

照明系统，用于生成多焦点照明光束；

进一步地，本技术方案中，所述照明系统包括激光器和位于其出射光路上的透镜组、微透镜阵列，激光器作为光源，用于生成激光，透镜组用于对激光扩束，调整光束尺寸，微透镜阵列用于接收激光，并在多个微透镜的聚光作用下生成多个平行照明光束，后续对样品进行扫描时，可以提升扫描的效率，提升显微成像装置的成像速度。

扫描系统：接受照明系统产生的多焦点照明光束，通过扫描振镜的偏转实现对样品的扫描；

进一步的，所述扫描系统位于照明系统之后，即多焦点照明光束的输出光路上，荧光激发收集系统之前。