[发明专利]花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和应用。本发明通过设计sgRNA T1‑T4以构建CRISPR/Cas9基因组编辑系统，由sgRNA引导的Cas9酶在基因靶点对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A进行切割，经DNA修复后产生基因序列的插入或碱基的突变，从而完成对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的靶向突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶，无法催化油酸脱氢产生亚油酸，有利于获得高油酸含量的花生，改良花生品种的品质。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种花生突变体的制备方法、一种花生突变基因及其编码的蛋白质和应用，以及一种用于检测花生突变基因的引物。

背景技术

花生作为优质食用油的原料，是我国重要的油料作物和经济作物，其总产量和消费量占世界的40%以上，出口量占世界的55%以上（联合国数据中心，2012），在国际上具有很强的竞争力。花生种子含油量非常丰富，平均含油量可达51%左右，广受市场欢迎。花生油的主要成分有单不饱和脂肪酸油酸（C18:1，Δ9）、多不饱和脂肪酸亚油酸（C18:2，Δ9，Δ12）以及饱和脂肪酸棕榈酸（C16:0）和硬脂酸(C18:0)组成，其中，不饱和脂肪酸约为80％(油酸36％-67％，亚油酸15％-43％)，饱和脂肪酸占20％(棕榈酸6％-11％，硬脂酸2％-6％，花生酸5％-7％，山嵛酸2％-3％)。花生种子中的脂肪酸组成及其含量是衡量其品质优劣的重要指标。油脂稳定性方面，亚油酸属多不饱和脂肪酸，其油酰残基易氧化而导致油脂腐败劣变，严重影响油脂储存期；而油酸分子只含有一个双价不饱和键，化学结构相对比较稳定，抗氧化能力强，油酸的自氧化性比亚油酸稳定10倍，油酸/亚油酸比例高的花生更耐储存，在精炼、储藏和煎炸时不易变质，与普通花生相比，高油酸含量的花生具有更长的货架期。营养价值方面，花生油的品质对花生油固定消费人群的健康具有重要影响。油酸的营养价值较高，其可降低血液中低密度脂蛋白的含量，同时维持有益高密度脂蛋白水平，更有效地保护心脑血管，还能逆转炎性细胞因子TNF-α对胰岛素产生的抑制作用。在食品健康越来越受重视的今天，高油酸比例的食用油是众多食品加工企业平衡饱和脂肪酸和非饱和脂肪酸使用的一个优佳选择。因此，提高油酸含量已经成为花生品质育种的一个重要目标。

去饱和脂肪酸酶(Δ12FAD或FAD2)是催化油酸的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸的关键酶，它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。分子生物学研究越来越多的证据表明，AhFAD2是油酸生成亚油酸的关键基因，决定花生种子中油酸和亚油酸的相对含量。栽培种花生(Arachis hypogaea)是具有基因组A和基因组B的异源四倍体物种(2n＝4x＝40)，AhFAD2由位于不同基因组上的2对非等位同源基因AhFAD2A和AhFAD2B共同编码，它们分别来源于花生野生种A和B基因组，该2个基因均不属于种子特异表达基因，在普通油酸含量花生品种中这2个基因或者其中之一能正常表达，而在高油酸品种中，AhFAD2A和AhFAD2B基因均突变共同导致高油酸性状的产生。