[发明专利]植物导引模板原位合成基因编辑方法及应用

权利要求书

1.一种导引基因编辑转化载体，其特征在于，所述导引基因编辑转化载体的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示，以pCambia3301载体骨架，从T-DNA右边界开始包含三个表达单元ZmU6pro:gRNA:AtU6-26term，ZmUBI1 pro: H840A突变的SpCas9-MMLV-RT:PsE9 term和35Spro:HYG:35S term，且在ZmU6 pro和gRNA骨架之间设置有BsaI酶切位点，用以插入任何gRNA或pegRNA。

2.根据权利要求1所述的一种导引基因编辑转化载体，其特征在于，所述的导引基因编辑转化载体的ZmU6启动子和gRNA骨架之间插入pegRNA得到；所述pegRNA由三部分构成：

(1)基因编辑gRNA，包括20bp目标基因识别序列和gRNA骨架；

(2)延伸在gRNA骨架3’端区域的基因编辑模板片段；

(3)延伸gRNA骨架3’端区域的基因编辑模板片段下游，与(1)中gRNA的20bp目标基因识别序列中部分序列互补的引物配对片段。

3.一种构建权利要求1所述的导引基因编辑转化载体的方法，其特征在于，构建如序列8所述的导引基因编辑转化载体，包括以pCambia3301为载体骨架，从T-DNA右边界开始包含三个表达单元：第一单元为ZmU6pro:gRNA:AtU6-26term；第二单元为ZmUBI1 pro: H840A突变的SpCas9-MMLV-RT:PsE9 term；第三单元为35S pro:HYG:35S term；

所述第一单元包括以下步骤：

（1）克隆玉米U6细胞核小RNA基因获得ZmU6 pro启动子表达gRNA；

（2）在ZmU6 pro和gRNA骨架之间设置有BsaI酶切位点，用以插入任何gRNA或pegRNA；

所述第二单元包括以下步骤：

S1：克隆玉米泛素基因获得启动子ZmUBI1 pro表达Cas9；

S2：将Cas9核酸内切酶突变为切口酶并融合连接RNA逆转录酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2包括：

S21：根据已知的用于导引基因编辑的突变RNA逆转录酶MMLV-RT序列，人工合成了包括H840A突变的部分Cas9和MMLV-RT基因表达序列，得到H840A 突变的Cas9-MMLV-RT融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

S22：编码预期的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的H840A 突变的Cas9切口酶和RNA逆转录酶融合蛋白序列，其氨基端和羧基端分别有一个氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的SV40细胞核定位短肽。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S2中，H840A 突变的Cas9切口酶和RNA逆转录酶之间由一个氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的Nucleoplasmin细胞核定位短肽和一个氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的可塑短肽连接。

6.一种植物的遗传转化方法，其特征在于，将权利要求2所述的导引基因编辑转化载体导入受体植物细胞，再筛选得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

7.根据权利要求6所述的植物的遗传转化方法，其特征在于，所述转化包括以下步骤：

(1)受体植物细胞进行遗传转化得到再生植株；

(2)检测再生植株的基因编辑是否成功；

(3)筛选得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。

8.根据权利要求7所述的植物的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：

1)愈伤组织的诱导；

2)愈伤组织的继代培养；

3)愈伤组织的侵染；

4)抗性愈伤组织筛选和鉴定；

5)愈伤组织分化成苗；

6)生根培养；

7)驯化移栽得到再生植株。