[发明专利]人MED12基因突变的数字PCR检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种人MED12基因突变的数字PCR检测方法及应用。具体地，提供了优选的针对MED12 G44所在序列的引物对、扩增方法、核酸探针以及检测体系，进一步还提供了用于检测MED12基因突变的试剂盒。本发明通过优化的引物对和探针以及相应反应条件，从而可以对不同样本高灵敏度、强特异性地检测MED12基因突变。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体地，涉及人MED12基因突变的数字PCR检测方法及应用。

背景技术

MED12(Mediator complex subunit 12,MED12)基因位于X染色体上，人的 MED12基因是由45个外显子构成，长度约为25000bp。MED12在生理情况下通过调控相关基因的转录与表达，实现调节细胞的生长、分化等功能。因此，一旦MED12 基因序列发生突变，将会导致相关疾病的发生。

子宫肌瘤是妇科常见的良性肿瘤，子宫肌瘤最主要的临床表现是异常子宫出血、盆腔痛和贫血，其对女性生活质量的影响不容忽视。国外有研究报道子宫肌瘤中中介体复合物亚基12(Mediator complex subunit 12,MED12)基因的高频突变，其中约70％的子宫肌瘤患者病灶组织中存在该基因突变，且大部分(90％)位于 MED12基因的第44位甘氨酸(MED12 p.G44)。

目前，已经在多种肿瘤中发现了MED12突变，除了子宫肌瘤，还在乳腺纤维上皮肿瘤中发现MED12基因突变。

研究发现，MED12突变阳性的子宫肌瘤通常与浆膜下型相关，其肿瘤数目与胎次成反比；而无MED12突变的子宫肌瘤，其数目和盆腔炎病史相关。此外，MED12 阳性突变的子宫肌瘤比阴性的病变体积更小，组织病理学上更常规。因此，针对 MED12的突变检测，能帮助临床医生更好地对子宫肌瘤进行分类，预测肿瘤数目、组织形态。

尽管目前市场上还没有针对MED12突变的肿瘤靶向药，但是不排除未来有相关药物产生的可能，对相关肿瘤MED12突变的检测，有助于未来指导用药等治疗手段。

尽管肿瘤组织和肿瘤细胞学样本是突变检测的最佳样本，但此类样本获取难度大。检测血浆中的游离核酸(Circulating free DNA,简称“cfDNA”),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfDNA的变化，进而监控病情变化。

然而，采用无细胞的核酸(如cfDNA)作为肿瘤患者中的生物标志物存在一定难度，尤其是应用cfDNA检测准确并特异地检测基因突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中的cfDNA含量因人而异，而且大部分情况都非常低,而其中肿瘤来源的游离核酸(Circulating tumor DNA,简称“ctDNA”)的质量更是参差不齐、含量高低不一。

不仅如此，cfDNA检测方法特异性有待提高。Douillard等人报道，使用血浆检测EGFR突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。

此外，目前虽然有一些基于cfDNA来检测MED12基因突变的方法，但是这些方法的灵敏度和特异性尚难以令人满意。

因此，本领域迫切需要开发基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测RAS基因突变的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测MED12 基因突变的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测基因突变的试剂，所述试剂包含用于检测MED12 G44突变的第一引物对，其中第一引物对包括SEQ ID No:1和 2所示的引物。

在另一优选例中，所述的MED12 G44所在序列位于NG_012808.1：5786～5882。