[发明专利]中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法

说明书

本发明适用于蜜蜂嗅觉系统分析技术领域，提供了中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，选用中华蜜蜂气味受体AcerOr1作为研究对象，从体内外探讨了它潜在的生物学功能。对AcerOr1蛋白结构亚细胞定位进行预测发现其亚细胞定位于细胞膜。膜拓扑结构预测发现AcerOr1的序列结构上没有预测到有钙调蛋白结合位点区域和气味配体离子门控通道的存在。成功构建真核表达载体pIB/V5‑AcerOr1并建立稳定转染细胞系；Western blot结果证明重组后的真核表达载体能在昆虫细胞Sf9中表达；免疫荧光显示重组后的真核表达载体在Sf9细胞膜上表达，与预测结果一致。AcerOr1能够和Sf9内源性Orco在Sf9细胞膜上形成离子通道，与传统气味受体形成异源二聚体具有气味配体门控通道的作用，当细胞受到外界刺激后，能引起Ca²⁺浓度变化。从而可以根据实验结果分析AcerOr1对中华蜜蜂的嗅觉功能的作用，实验操作方便，为中华蜜蜂嗅觉系统的研究提供了有效的理论依据。

技术领域

本发明属于蜜蜂嗅觉系统分析领域，尤其涉及中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法。

背景技术

中华蜜蜂依赖其灵敏的嗅觉系统在周围环境中觅食。气味受体的一个主要功能是对气味的识别和编码，这些受体结合不同的气味分子，产生信号级联，打开离子通道，并从嗅觉感觉神经元向大脑发送电信号。与哺乳动物G蛋白偶联受体相比，昆虫OR具有与之既然相反的7个跨膜拓扑结构，即C末端在胞外端，N端在细胞内，它们与哺乳动物气味受体间没有同源性。在体内，气味受体主要在嗅觉神经元表达，参与了嗅觉识别的初始过程。每个嗅觉神经元表达两类气味受体：高度保守的共受体Orco和传统的气味受体。Orco不能识别气味分子，但是它可以帮助传统气味受体在树突膜上的折叠和正确定位，且在不同昆虫间高度保守。传统气味受体则在不昆虫间差异较大。

随着转录组测序广泛应用，越来越多的ORs被鉴定出来，但是受体的配体鉴定仍然很落后，导致许多气味受体仍然是孤儿受体。经转录组测序在中华蜜蜂体内已经鉴定出119个气味受体，意大利蜜蜂鉴定出超过177个气味受体，但是到目前为止只在意大利蜜蜂上鉴定出少数几个气味受体的配体，意大利蜜蜂Or151在工蜂中高表达并能结合芳樟醇；AmOr11在雄蜂中表达并特异性识别9-氧代-2-癸烯酸(9-ODA)；表明蜜蜂嗅觉受体结合气味与气味检测环境有关。

发明内容

本发明提供中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，旨在解决利用体外异源表达的细胞对中华蜜蜂气味受体基因AcerOr1功能进行分析验证。

本发明是这样实现的，中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，包括以下步骤：

S1、亚细胞定位及跨膜结构域预测；

S2、设计含有酶切位点BamHI和EcoRI保护碱基的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1的上、下游引物，扩增PCR；

S3、构建真核表达载体pIB/V5-AcerOr1；

S4、将所述重组表达载体用脂质体转染的方法转染至Sf9细胞；

S5、Westernblot检测目的蛋白的表达；

S6、细胞免疫荧光鉴定目的蛋白的的亚细胞定位；

S7、运用钙离子成像实验，检测目的蛋白AcerOr1潜在的功能活性。

优选的，所述利用在线网站http://linux1.softberry.com/all.htm对AcerOr1蛋白结构亚细胞定位进行预测。

优选的，将所述通过HMMTOP 2.0和TMHMM 2.0对中华蜜蜂气味受体AcerOr1的跨膜结构域进行预测。