[发明专利]一种检测呼吸道病原体多重real-time PCR试剂盒、方法和应用

说明书

本发明涉及一种检测呼吸道病原体多重real‑time PCR试剂盒、方法和应用，所述试剂盒包括用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、人鼻病毒和人偏肺病毒的试剂，所述试剂包括用于检测上述病毒的探针和特异性扩增相应病毒靶标基因的引物对、反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照；所述甲型流感病毒的检测通道为FAM，所述乙型流感病毒的检测通道为VIC，所述人鼻病毒的检测通道为Texas Red，所述人偏肺病毒的检测通道为Cy5。本发明所述试剂盒可以同时检测上述四种病毒，且在具有高灵敏性和特异性的同时，还简化了操作过程、缩短了检测时间、提高了检测通量、降低了检测成本，并且能够在多种荧光定量PCR仪普遍适用。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种检测呼吸道病原体多重real-timePCR试剂盒、方法和应用。

背景技术

目前临床对呼吸道病原体的诊断主要依赖传统的分离培养法，培养法虽然是临床病原诊断的金标准，但是仍存在一定的局限性，包括：(1)大量病原体培养难度高或无法进行体外培养；(2)阳性率低，假阴性率高(经常高达50％以上)；(3)检测耗时长：常规检测需要1-4天，某些慢生长型病原体需要3-4周才能获得培养结果；(4)操作繁琐：对操作者要求高，结果重复性不佳。

除了传统的分离培养法，目前市场上针对呼吸道病原体的检测方案多以核酸检测为目的，这些检测方案依赖不同的技术原理。例如：(1)梅里埃的FilmArray RP panel，针对20种呼吸道病毒和细菌分别设计了一对内引物和一对外引物，通过巢式PCR扩增样本的核酸，产物进行溶解曲线分析，根据不同产物的溶解峰(Tm值)不同从而鉴定病原；(2)海尔施的13种呼吸道病原体多重检测试剂盒，先对样本核酸进行多重PCR扩增，然后扩增产物通过毛细管电泳分析，根据产物片段的大小鉴别不同的病原体；(3)博奥的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，该试剂以环介导等温扩增+芯片检测技术为基础，可以快速检测6种呼吸道常见病毒。但是梅里埃的FilmArray RP panel虽然操作简单、快速且高度自动化，不过必须借助FilmArray自动化分析平台才能实施，使用范围受限。海尔施的13种呼吸道病原体多重检测试剂盒虽然可以实现一管反应多重检测，但除依赖PCR仪之外还需要专门的毛细管电泳仪才能对产物进行分析，不仅毛细管电泳分析过程会延长检测周期，并且扩增产物开盖还容易引起实验室气溶胶污染。博奥的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒测范围较窄，并且必须借助配套的恒温扩增微流控核酸分析仪才能实施，此外检测通量受仪器限制。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明旨在开发一种能够鉴定数种呼吸道常见病原体的多重检测试剂盒，力求在保证高灵敏性和特异性的同时，尽量简化操作过程、缩短检测时间、提高检测通量、降低检测成本，并且能够在多种荧光定量PCR仪普遍适用。

本方案以Real-time PCR(Taqman探针)技术为原理，针对每一种检测靶标分别设计一对特异性引物和一条Taqman探针，Taqman探针为一段与靶序列互补并且高度特异的寡核苷酸序列，其5’端标记一个荧光报告基团，3’端标记一个荧光淬灭基团，在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号；当引物延伸时，与模板结合的荧光探针被Taq酶(5’→3’外切酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在多重qPCR中，每一个靶标都被一套不同的引物扩增，且每一个靶标的特异性探针分别标记不同光谱范围的荧光基团，荧光定量PCR仪可根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，最终通过检测到的荧光信号来判定不同的扩增产物。

本发明采用的技术方案为：

一种检测呼吸道病原体多重real-time PCR试剂盒，包括用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、人鼻病毒和人偏肺病毒的试剂。