[发明专利]一种角膜缘上皮干细胞分离培养方法

权利要求书

1.一种角膜缘干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

（1）无菌条件下获取角膜并清洗；

（2）减除残留的巩膜、结膜和虹膜；

（3）加入中性蛋白酶II4°C过夜消化，轻微搅动；

（4）将加入中性蛋白酶II的角膜放人4°C摇床摇30min；

（5）用DMEM/F-12/GASP清洗角膜；

（6）解剖显微镜下，小心去除角膜中央的上皮细胞并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞，去除过程中多数的中央上皮细胞已经剥脱；

（7）用胰蛋白酶/EDTA消化角膜缘上皮细胞片；

（8）加入等体积DMEM/F-12/2FB/GASP；

（9）离心，弃上清；

（10）用DMEM/F 12/GASP清洗，离心，弃上清；

（11）加入LSC培养基，培养基配方具体为：5mL 100×双抗、10～20ng/ml人重组EGF、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、皮质醇(Hydrocortisone)0.5μg/mg、5-10ng/ml白介素-6、15～20％胎牛血清、余量为DMEM/F12，将细胞拍散并用血细胞计数板计数；

（12）将细胞以一定密度接种至铺有3T3饲养层的组织培养皿或准备好的人羊膜上，每三天更换一次培养基，流式细胞检测表面标志物的阳性表达率；

（13）当细胞汇合度达到90%时用胰蛋白酶消化传代；

（14）细胞收集，冻存。

2.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述角膜清洗液为CMF-Saline G，清洗3✕5min。

3.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述中性蛋白酶II加入2-3ml。

4.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（5）角膜清洗液为CMF-Saline G，清洗3✕5min。

5.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（7）消化时间为3-5min。

6.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（9）离心条件为400g离心10 min。

7.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（12）中细胞密度为1✕10⁴ /cm² 。

8.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（13）胰蛋白酶消化时间为3-5min。

9.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（13）的传代过程为：

a.弃掉培养基；

b.用CMF-Saline G洗一遍；

c.加入胰蛋白酶/EDTA 37℃，10min；

d.当细胞收缩，加入等体积的DMEM/F 12/GASP；

e.400g离心10min，计数。