[发明专利]一种利用纳米孔进行细菌耐药性的快速检测方法、装置和系统

权利要求书

1.一种非诊断目的的区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，利用纳米孔检测探针与肺炎克雷伯菌生物标识结合后产生的复合物的特异性信号，并利用对所述特异性信号的检测来区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌，包括以下步骤：

1）提取肺炎克雷伯菌总RNA；

2）设计双探针，并制备16SrRNA-探针复合物，所述复合物分别由探针A和B和肺炎克雷伯菌的16S rRNA通过退火形成，所述探针A和B的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；

3）通过纳米孔检测所述16SrRNA-探针复合物的转运信号，所述纳米孔为MspA；

4）分析通过所述MspA纳米孔的转运信号，选择阻塞率0.6至0.8，滞留时间100毫秒至400毫秒范围的转运信号作为特异性信号；

5）使用f = 0.1•min ^-1 作为目标信号转运频率阈值来区分不同肺炎克雷伯菌，高于0.1•min ^-1判定为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，低于0.1•min ^-1判定为碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）培养细菌浓度至2 MCF～10 MCF时，提取总RNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述培养细菌浓度为4 MCF。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）培养细菌时间长度为1小时～8小时，提取总RNA。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1）培养细菌时间长度为4小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的肺炎克雷伯菌培养时加入终浓度为16 mg/L的亚胺培南。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述16S rRNA-探针复合物由探针A和B和肺炎克雷伯菌的16S rRNA通过退火形成。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述纳米孔电生理信号检测在50～200毫伏的电压下进行。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3）所述纳米孔电生理信号检测在150毫伏的电压下进行。

10.一种16S rRNA-探针复合物在非诊断目的的区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌中的应用，其特征在于，所述16S rRNA-探针复合物由探针A和B和肺炎克雷伯菌的16S rRNA通过退火形成，所述探针A和B的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；所述16S rRNA-探针复合物在电驱动下通过MspA纳米孔产生转运信号；选择阻塞率0.6至0.8，滞留时间100毫秒至400毫秒范围的转运信号作为特异性信号；使用f = 0.1•min ^-1 作为目标信号转运频率阈值来区分不同肺炎克雷伯菌，高于0.1•min^-1判定为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，低于0.1•min ^-1判定为碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌。

11.一种区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌的装置，其特征在于，所述装置包括MspA纳米孔、探针、肺炎克雷伯菌RNA提取试剂单元、纳米孔电生理信号检测单元；所述探针为探针A和B，所述探针A和B的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述纳米孔电生理信号检测单元含有HEPES、KCl、双层脂质膜或高分子膜、DPHPC。

12.根据权利要求11所述的装置，其特征在于，所述肺炎克雷伯菌RNA提取试剂单元含有TRIZOL、乙醇、DEPC水/无RNase水,和RNase抑制剂。