[发明专利]用于评估微生物对环境中铅离子解毒作用的生物检定方法

权利要求书

1.用于评估微生物对环境中铅离子解毒作用的生物检定方法；其特征是以本氏烟草为观测对象，通过本氏烟草种子在含铅微生物细胞悬液中的萌芽率以及本氏烟草幼苗在含铅土壤中生长的生物量来反映微生物对环境中Pb²⁺的固定能力；

所述微生物包括野生型宿主菌E.coli BL21(DE3)以及三株表面展示工程菌BL21(pR-FL)、BL21(pR691-FL)和BL21(pD-FL)；其中BL21(pR-FL)中的重组质粒pR-FL核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；BL21(pR691-FL)中的重组质粒pR691-FL核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；BL21(pD-FL)中的重组质粒pD-FL核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，本氏烟草种子在含铅微生物细胞悬液中的萌芽率表征步骤如下:

(1)受试微生物菌悬液制备:根据受试微生物对生长条件的要求，选择LB培养基和IPTG作为蛋白诱导剂，诱导培养24h后用ddH₂O洗涤制成OD₆₀₀＝3的细胞悬液；

(2)Pb²⁺添加:分别在各个受试微生物细胞悬液和同等体积的蒸馏水中添加500-2000μM的Pb²⁺并混合均匀，制成各个受试微生物含铅细胞悬液和不含微生物的Pb²⁺水溶液；

(3)种子排布:将预先灭菌并裁剪好的滤纸平放在无菌培养皿的底部，并将精确计数为50-100粒的本氏烟草种子均匀排布在滤纸上；

(4)烟草萌发:将步骤(2)中制备好的受试微生物含铅细胞悬液和不含微生物的Pb²⁺水溶液分别添加至步骤(3)的培养皿中，使液面高度刚好覆盖种子，然后将培养皿在白光照射下于25-28℃孵育；

(5)萌芽率计算:当种皮破裂可见时，认为种子已经萌发，计算种子的发芽率。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是，本氏烟草幼苗在含铅土壤中生长的检定方法表征步骤如下:

(1)烟草种子萌发:在培养皿底部放无菌纱布，将本氏烟草种子均匀排布在纱布上，每天用ddH₂O喷洒，充分润湿种子和纱布，将其置于室温下萌发25-30天；

(2)受试微生物菌悬液制备:根据各个受试微生物对生长条件的要求，选择LB培养基和IPTG作为蛋白诱导剂，诱导培养24h后制成OD₆₀₀＝3的细胞悬液；

(3)含铅土壤的制备:先向步骤(2)中受试微生物细胞悬液和同等体积的蒸馏水中添加500-2000μM的Pb²⁺并混合均匀，制成受试微生物含铅细胞悬液和不含微生物的Pb²⁺水溶液；然后将预先灭过菌的植物生长营养土与上述含铅溶液以1∶1(v/w)的比例混匀，充分润湿土壤，制成铅污染的植物生长营养土；

(4)烟草植物培养:将步骤(1)的本氏烟草幼苗移栽至步骤(3)的营养土中，放在阳光充足的温室里，每两天浇水一次连续培养20-50天；

(5)植株称重:将植株从盆中取出，处理干净根部的泥土，称量植株生物量。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是，步骤(3)中，植物生长营养土采用高温高压蒸汽灭菌法，条件为121℃灭菌20min，然后在55-65℃烘箱中放置24h以充分烘干土壤。

5.如权利要求1所述的评估微生物对环境中铅离子解毒作用的生物检定方法在铅离子污染环境的原位修复中的应用。