[发明专利]HGMS2菌株突变体在制备4-雄甾烯-3,17-二酮（4-AD）中的应用

说明书

本申请提供了HGMS2菌株突变体在制备4‑雄甾烯‑3,17‑二酮(4‑AD)中的应用，其中，HGMS2菌株突变体的KstD和Ksh基因被敲除。本申请的敲除KstD和Ksh基因的HGMS2菌株与野生型HGMS2菌株相比，敲除型菌株显著降低了ADD和9‑OH‑AD的产生。此外，在发酵中敲除KshA和KstD基因的突变菌株，提高了4‑AD产量，减少了杂质。

技术领域

本申请涉及生物领域，具体地，涉及HGMS2菌株突变体在制备4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)中的应用。

背景技术

类固醇起抗菌、消炎、抗病毒和抗癌治疗的作用，类固醇的核心结构通常由三个六元环己烷环和一个五元环戊烷环组成。高级甾体药物的合成依赖于最重要的起始原料4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。4-AD的生产更为重要，因为后者可以由4-AD合成。

目前，4-AD是由含有不完全甾体降解途径的细菌对植物甾醇进行生物转化而产生的环境友好型物质(使用具有不完整类固醇降解途径的细菌通过植物甾醇的生物转化以环境友好的方式生产4-AD)。尽管许多放线菌都含有类固醇降解途径，包括假单胞菌NCIB10590和单形诺卡氏菌VKM Ac-2033D，但是只有分枝杆菌属的菌株才适合工业应用。从自然界中分离出来的分枝杆菌NRRL B-3805是第一种用于将植物甾醇工业规模转化为4-AD的细菌。随后还分离出了用于工业应用的其他分枝杆菌菌株，例如分枝杆菌NwIB-01和分枝杆菌HGMS2。到目前为止，所有这些菌株都属于新金分枝杆菌组。然而，这些菌株在植物甾醇转化过程中产生多个4-AD类似物，使得4-AD产量的提高及其在工业中的纯化遇到困难。

在过去的十年中，细菌类固醇降解途径的分子机制的揭示得益于关键酶的生化特性、基因簇的识别以及对分解类固醇的不同细菌的基因组注释的综合信息。总的来说，9,10-开环甾类化合物的形成是一个核心通路，并进一步扩展为三条通路，即胆固醇降解途径、胆酸降解途径和睾丸激素降解途径。调控细菌降解植物甾醇涉及的基因多达260个。用于植物甾醇生物转化的工业微生物主要利用胆固醇降解途径来氧化3-羟基并降解植物甾醇的侧链，然后积累类固醇中间体。M.NRRL B-3805在不完全降解4-AD的情况下，使用11种酶连续14个步骤分解植物甾醇。耻垢分枝杆菌有一个与胆固醇降解途径不同的额外基因簇，用于C和D甾体环的代谢。红球菌RHA1菌株的胆固醇降解途径对ADD和3,4-DHSA的降解表现出更强的活性。新金黄色葡萄球菌ATCC 25795中的胆固醇降解途径使用羟类固醇脱氢酶(Hsd4A)作为分子开关，以区分两种竞争性分支途径，即固醇侧链降解的AD和HBC子途径。

在细菌的胆固醇降解途径中，两个最重要的关键酶3-甾酮-1，2脱氢酶(KstD)和3-甾酮-9α-羟化酶(Ksh)在C9,10位引起B环断裂。KstD是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性酶，可在3-酮类固醇底物A环的C1和C2原子之间的位置引入双键。在NCBI蛋白质数据库中的一项搜索显示，超过500种不同的微生物含有推测的KstD酶基因，主要在放线菌门属中。重要的是，单个物种可能包含多个底物特异性的KstD。例如，红球菌菌株有三种不同的KstD基因。新金分枝杆菌DSM 1381也含有三种不同的KstD酶基因，而Gordonia neofelifaecisNRRL B-59395含有多达五个KstD酶基因。每个菌种每个KstD酶在氨基酸序列和三维构象方面均表现出独特性。

尽管已采用传统的UV或者化学介导的突变策略和现代代谢工程技术来提高4-AD和其他固醇化合物的生产率，但由于植物甾醇降解途径的复杂性，相关进展并不显著。

发明内容

为了解决上述问题，本申请提供了一种HGMS2菌株突变体在用于制备4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)中的应用，其中，所述HGMS2菌株突变体的KstD和Ksh基因被敲除。