[发明专利]双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE，其制备及在抗肿瘤中的应用

权利要求书

1.一种编码双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸，所述多核苷酸包含通过(Gly4Ser)3连接肽编码序列连接在一起的CD3纳米抗体的基因序列与FAP纳米抗体的基因序列，所述多核苷酸的序列为SEQ ID No. 2。

2.一种包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多肽，多肽包含通过(Gly4Ser)3连接肽连接在一起的CD3纳米抗体与FAP纳米抗体，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

3.一种制备双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1) 获得一对引物，其中：上游引物为：5′-CGCGGATCCATGGGCA CTGCTACCGTTGAG-3′，引入酶切位点KpnI；下游引物为5′-CCAAGCTGGTACAAGAGCTGCTTTGCTTGTG-3′，引入酶切位点HindⅢ；

(2) 利用所述一对引物，以重组质粒PUC57-CD3-FAP/nanoBiTE为模板进行PCR扩增；

(3) 将PCR产物经KpnI和HindⅢ双酶切消化后，使用T7 DNA 连接酶连接到酶切后的pET-30a载体中，构建重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE；

(4) 将重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；

(5) 诱导CD3-FAP/nanoBiTE蛋白的表达；

其中，所述CD3-FAP/nanoBiTE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 1。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：

在步骤(2)中，扩增条件为：92℃预变性: 2分钟，循环设定为：92℃变性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸90 s，30个循环，最后72℃延伸10分钟；

在步骤(4)中采用热激法，所述热激法为10 μL pET-CD3-FAP/nanoBiTE在冰上放置30分钟，42℃水浴热激90秒；和/或

在步骤(5)中，所述蛋白表达方法为将阳性菌落在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养OD600至0.6，加入IPTG诱导CD3-FAP/nanoBiTE表达，采用15% SDS-PAGE检测蛋白表达情况。

5.一种制备包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸的方法，所述制备方法包括如下步骤：

扩增纳米抗体anti-CD3 Nb的编码序列；

扩增纳米抗体anti-FAP Nb的编码序列；

将步骤(1)获得的编码序列与步骤(2)获得的编码序列通过( Gly4Ser )3的编码序列进行连接，

其中，所述双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸序列为SEQ ID No. 2。

6.权利要求1所述的多核苷酸和/或权利要求2所述的多肽在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用；所述肿瘤为表达成纤维细胞活化蛋白的肿瘤；所述肿瘤为实体瘤。