[发明专利]一种交联酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种交联酶的制备方法，将多酚氧化酶与谷氨酰胺转氨酶溶液混合反应，获得粒径大小几微米至几十微米、活力大小不同的交联酶微粒，通过过滤、离心等方式可以将制备得到的交联谷氨酰胺转氨酶从溶液中分离出来，制得的交联酶用于蛋白质药物分子的聚乙二醇(PEG)修饰等。交联谷氨酰胺转氨酶在使用过程中，容易回收、可以反复利用、不会对产物分离造成负担，大大降低了生产成本。该方法交联过程绿色环保、温和高效、反应可控，而且不需要载体，也不需要对谷氨酰胺转氨酶纯化，还可以多种酶一起交联固定化。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种交联酶的制备方法。

背景技术

天然酶(例如谷氨酰胺转氨酶)一般是溶解于水溶液中催化反应，反应结束后必须通过加热、加酸碱等方法灭活酶，昂贵的酶无法回收、只能使用一次，是一种极大的浪费。谷氨酰胺转氨酶(E.C.2.3.2.13)催化多肽链上谷氨酰胺转氨残基(酰基供体)与各种伯氨基(酰基受体)化合物(包括赖氨酸残基)之间的酰基转移反应，形成异肽键，从而实现蛋白质交联或者修饰。谷氨酰胺转氨酶催化蛋白质交联，可以改善食品质地和功能，提高产品价值，因此已经被商业化用于食品加工过程。谷氨酰胺转氨酶的另一个重要应用就是修饰蛋白质，如蛋白质药物的聚乙二醇(PEG)修饰、糖基化修饰等，其作用是延长蛋白质药物的半衰期、降低蛋白质药物的免疫原性，从而提高蛋白质药物的临床疗效。谷氨酰胺转氨酶法修饰蛋白质药物的特点是修饰位点高度特异性、反应温和、对蛋白质药物没有损伤，因此是目前定点修饰蛋白质药物最受关注、最重要的方法。游离谷氨酰胺转氨酶修饰蛋白质药物反应结束后，灭活处理不但是一种浪费，同时也会造成蛋白质药物的变性。固定化酶，可以解决上述问题。所谓固定化酶就是将能溶解于溶液中的酶变成不溶性的酶，但保留其催化活力，结束反应时，通过过滤、离心等方式很容易地从溶液中分离出来，方便控制反应进程，实现酶的重复利用。交联法是常用的固定化酶方法之一，通常是利用化学交联剂(如戊二醛)将酶蛋白之间共价连接。交联法固定化酶的优点是不需要载体、酶活力不会受到载体的影响。但是，化学交联法，对酶分子产生化学损伤，会降低酶的催化能力，而且存在化学残留。酪氨酸酶(E.C.1.14.18.1)和漆酶(E.C.1.10.3.2)都属于多酚氧化酶家族。酪氨酸酶催化多肽链上酪氨酸残基的酚羟基发生氧化反应生成邻苯二酚，进而催化邻苯二酚生成有活性的邻苯二醌，邻苯二醌之间发生自聚合或者与赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸残基等发生反应产生蛋白质交联。漆酶催化多肽链上酪氨酸残基氧化生成酚自由基，生成的自由基自发聚合导致蛋白质交联。两种酶都作用于酪氨酸残基，但是对酪氨酸残基位点的要求、反应机理存在差异。目前，研究者开始初步尝试将酪氨酸酶和漆酶用于食品蛋白质交联，改善食品品质、提高食品价值。总之，谷氨酰胺转氨酶、多酚氧化酶都是可以催化蛋白质交联的酶。在谷氨酰胺转氨酶修饰蛋白质药物的应用中，为了方便控制反应进程、实现酶的回收利用，需要一种温和高效的酶促固定化方法对谷氨酰胺转氨酶进行交联固定化，但现有的公开方案中，未见有酶促谷氨酰胺转氨酶固定化的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种交联酶的制备方法，利用多酚氧化酶的催化作用进行谷氨酰胺转氨酶的酶促交联，不需要载体，也不需要对谷氨酰胺转氨酶纯化，还可以多种酶一起交联固定化。

本发明的技术方案是：

一种交联酶的制备方法，该方法包括：

(1)将底物配制成蛋白质浓度为5-10mg/mL的第一溶液，将多酚氧化酶配制成浓度范围为1-10mg/mL的第二溶液；

(2)将所述第一溶液与所述第二溶液混合，在温度为20-50℃的条件下反应20min-24h后，离心、收集沉淀获得交联酶微粒。

进一步的，步骤(1)中，所述底物为一种多肽链中含有能够被多酚氧化酶特异性催化的酪氨酸残基的酶。

进一步的，步骤(1)中，所述底物为谷氨酰胺转氨酶。

进一步的，步骤(1)中，所述多酚氧化酶为漆酶、酪氨酸酶中的任意一种。