[发明专利]一种多功能化石墨烯载网及其制备方法

说明书

本发明公开了一种多功能化石墨烯载网(MFG载网)及其制备方法。MFG载网的制备方法包括如下步骤：刻蚀采用CVD生长的石墨烯薄膜覆盖的铜箔作为电镜载网，即得到石墨烯载网；将石墨烯载网进行氧等离子体处理；然后采用含有EDC和NHS的MES缓冲液处理石墨烯载网；再采用氨三乙酸和生物素活化石墨烯载网；最后与镍盐反应即得。本发明MFG载网能够特异性地将目标生物分子锚定在其表面上，从而避免了空气与水的界面问题，而且还能够控制颗粒取向分布，通过把相关的蛋白纯化标签构建到每个生物大分子的不同方向上，提供了丰富的欧拉角，并且让生物大分子的结构解析更加的可靠以及更加的高效，因此，MFG载网将促进在结构生物学分析中应用冷冻电镜的通用性和可重复性。

技术领域

本发明涉及一种多功能化石墨烯载网及其制备方法，属于生物冷冻电镜技术领域。

背景技术

由于冷冻电镜技术相关硬件和软件的持续发展，冷冻电子显微镜(cryo-EM)现在已成为解决生物大分子原子分辨率结构的常规方法，这极大地扩展了在分子水平上对生物学机制的理解。然而，该方法仍然面临一些关键的技术挑战，特别是对于冷冻样品制备而言。在实践中，将少量含有生物分子的溶液滴加到由支撑膜(例如多孔碳膜)覆盖的新鲜辉光放电的载网上，然后在液态乙烷中骤冷。理想地，预期生物分子将被定向富集地嵌入由无噪音膜支撑的薄玻璃化冰层中，但实际上并不是这种情况，并且生物分子的嵌入方向不可控。在大多数情况下，生物分子颗粒被吸收到空气-水界面中，这会导致生物分子的变性和优势取向问题，从而使后续的三维重构无法实现或结果不可靠。

面对这些问题，在冷冻样品制备中探索了无定形碳薄层作为支撑膜。然而，碳膜具有许多缺点，例如电子传导性差和背景噪声强，这导致在冷冻电镜数据收集过程中出现样品充电和目标信号浸没的问题。由于石墨烯及其衍生物具有超高的热/电导率，强大的机械强度和近乎无背景噪音的优异性能，因此也被用作冷冻电镜中的支撑膜。实际上，这些薄膜只能部分解决空气-水界面问题，而几乎不能控制冷冻样品中的颗粒分布。一些亲和力载网(例如功能化的石墨烯，脂质单层或碳膜和链霉亲和素二维晶体膜能够将目标分子锚定在膜的表面，从而使目标颗粒远离空气-水界面并处于更健康的状态。但是，这些亲和力载网无法特定地调节目标颗粒分子的方向，并可能引发更严重的优势取向的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种多功能化石墨烯载网(MFG载网)及其制备方法，MFG载网能够特异性地将目标生物分子锚定在其表面上，从而避免了空气与水的界面问题，而且还能够控制颗粒取向分布，通过把相关的蛋白纯化标签构建到每个生物大分子的不同方向上，提供了丰富的欧拉角，并且让生物大分子的结构解析更加的可靠以及更加的高效，因此，本发明提供的MFG载网将促进在结构生物学分析中应用冷冻电镜的通用性和可重复性。

本发明所提供的多功能化石墨烯载网的制备方法，包括如下步骤：

1)刻蚀采用CVD生长的石墨烯薄膜覆盖的铜箔作为电镜载网，即得到石墨烯载网(即电镜载网以及覆盖的石墨烯薄膜)；

所述电镜载网上设有孔阵列；

2)将所述石墨烯载网进行氧等离子体处理；

3)采用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液处理所述石墨烯载网；

所述2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中含有1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基-磺基琥珀酰亚胺；

4)然后采用氨三乙酸和生物素活化步骤3)处理后的所述石墨烯载网；

5)将步骤4)处理后的石墨烯载网与镍盐反应即得到所述多功能化石墨烯载网。

上述的制备方法中，步骤1)中，CVD法和刻蚀均可按照现有方法进行；

所述电镜载网上孔直径为30～50微米，优选30微米。