[发明专利]基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜及方法和应用

权利要求书

1.一种基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜，其特征在于，该仿生羊膜具有hAAM-AAM-hAAM的夹心结构，hAAM为人脱细胞羊膜，不含羊膜上皮细胞，hAAM的一面保留新鲜羊膜的呈纤维组织网状交错分布的三维结构，即上皮细胞下方的网状纤维，另一面保留了新鲜羊膜原有的基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层；AAM为通过羊膜间充质干细胞hAMSCs与BD基质胶制备的人工羊膜，两个hAAM的网状纤维面均处于内侧，AAM处于两个hAAM之间，且AAM中的hAMSCs通过细胞-基质连接结构定植于两层hAAM的网状纤维面的网孔中。

2.根据权利要求1所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜，其特征在于，所述AAM的厚度为2~4mm。

3.根据权利要求1所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜，其特征在于，所述AAM中，hAMSCs的细胞浓度为3~5×10⁵/mL。

4.根据权利要求1所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜，其特征在于，所述hAAM为通过将人新鲜羊膜组织依次经过戊二醛的交联和胰蛋白酶的消化，使人新鲜羊膜组织的上皮层细胞松解、脱落率达80%以上而获得的，其厚度为0.02~0.5mm。

5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜的制备方法，其特征在于，该方法包含：

将一片hAAM置于Transwell小室内底部，hAAM的网状纤维面向上，在其上放置AAM，再将另一片hAAM覆盖于在AAM上，且hAAM的网状纤维面向下与AAM接触，将Transwell小室置于加有相同培养基的孔板中，保证两层hAAM和中间AAM在培养期间的营养条件，从而使AAM中的hAMSCs通过细胞-基质连接结构定植于两层hAAM的网状纤维面的网孔中，形成具有hAAM-AAM-hAAM夹心结构的膜，获得基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述AAM的制备为，用无血清的DMEM/F12培养基按1: 3稀释BD基质胶，在冰浴中融化稀释的BD基质胶，于冰浴中将hAMSCs与BD基质胶按1: 1混合注入孔板中，制成细胞浓度为3×10⁵/mL的薄膜，在37℃培养使其成胶，加入适量DMEM/F12完全培养基，获得AAM。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，稀释后的BD基质胶的浓度为50μL/cm²生长面积。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述hAMSCs的提取为，将新鲜羊膜剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化，加入Ⅱ型胶原酶消化，收集细胞滤液并离心，重悬于含10%胎牛血清和100U/mL青链霉素的DMEM/F12培养基中，在37℃孵育；当细胞融合达到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，1: 3传代培养，获得3~5代生长状态好的hAMSCs。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述hAAM的制备为，将除杂后的人新鲜羊膜组织与戊二醛交联，使用0.25%胰蛋白酶消化至上皮层细胞松解、脱落率达80%以上，去除多余的胰蛋白酶，获得hAAM。

10.如权利要求1-4中任意一项所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜的应用，其特征在于，该仿生羊膜用于制备宫腔内移植产品。