[发明专利]用于COVID-19药物筛选的慢病毒表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种用于COVID-19药物筛选的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，

是以pCW-Cas9-Blast为骨架载体，将nCoVN cDNA亚克隆到所述骨架载体中，构成新型冠状病毒核衣壳蛋白的慢病毒表达载体pCW-Puro-T2A-nCoVN；

其中，所述nCoVN cDNA带有一个6×his标签和嘌呤霉素抗性基因。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从pCW-Cas9质粒上扩增两端带有NheI和AvrII酶切位点的Puro-T2A片段；并对含有核衣壳蛋白序列的pUC57质粒的N蛋白基因全长序列进行扩增，得到N端带有6×his标签和NheI酶切位点，另一端带有BamHI酶切位点的nCoVN片段；

(2)使用限制性内切酶NheI和AvrII对得到的Puro-T2A片段进行酶切，同时使用限制性内切酶NheI和BamHI分别对pCW-Cas9-Blast质粒和扩增得到的nCoVN片段进行酶切；

(3)经酶切后，得到Puro-T2A基因片段、nCoVN基因片段的双酶切产物，pCW-Cas9-Blast质粒分为两条约为7.4kb和4.3kb的片段，回收7.4kb的片段；

(4)使用T4连接酶将Puro-T2A和nCoVN基因片段连接到7.4kb的pCW-Cas9-Blast质粒片段上，获得含有Puro-T2A-nCoVN基因的质粒pCW-Puro-T2A-nCoVN；

其中，所述步骤(1)中，两个扩增的PCR反应体系为：

所述步骤(1)中，两个扩增的PCR扩增程序为：

扩增用到的引物序列如下：

CoVN-6His-NheI-F：ttgctagccatcaccatcaccatcacatgtctgataatggacc；

CoVN-BamHI-R：agggatccttaggcctgagttgagtcagcactgc；

Puro-NheI-F：ttgctagcatggccaccgagtacaa；

T2A-AvrII-R：cctaggtgggccaggattct。

3.根据权利要求1或2所述的方法构建得到的用于COVID-19药物筛选的慢病毒表达载体。