[发明专利]番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用和植物过表达载体

说明书

本发明公开了番茄miR156e‑3p基因及其在植物低温抗性中的应用和植物过表达载体。所述的参与番茄低温调控的基因miR156e‑3p，其成熟体序列如SEQ ID NO.1所示，前体序列为SEQ ID NO.2所示。通过转基因手段构建番茄miR156e‑3p过表达植株和基因沉默植株，调控所述基因miR156e‑3p的表达水平来研究其对番茄低温抗性的调控机制。结果发现，miR156e‑3p基因沉默植株可以提高番茄的低温抗性，过表达植株的低温抗性降低。本发明为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究番茄植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

技术领域

本发明涉及基因工程、分子生物学及生理学等领域，尤其涉及一种番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用和植物过表达载体。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)这一园艺作物起源于热带、亚热带地区，喜温。番茄果实富含维生素和矿物质，既可鲜食作蔬菜又可作水果，对人体心血管系统的保护和日晒后皮肤的修复有重要作用，是当之无愧的“菜中之果”。番茄作为反季节蔬菜主要在冬春季进行设施栽培，其生长发育阶段为低温胁迫所造成的损失尤为严重，因此提高番茄应对不良环境的能力，培育抗性品种具有重要的实际生产意义。

近年来，随着全球气候的极端变化，低温逐渐成为作物生长发育的重要限制因素，对植物的正常生长和农业生产造成了极大的破坏。因此，探究蔬菜作物对低温的响应机制，剖析低温应答的关键因子，激活蔬菜作物的低温抗性，为耐低温植物的获得提供重要的理论支持，对保障蔬菜周年生产和商品供应、提高蔬菜产量、改善蔬菜品质和促进蔬菜产业可持续发展具有深远的科学意义和现实意义。

microRNA(miRNA)是一类内源性单链非编码RNA分子，其长度约为20-24个核苷酸，广泛存在于真核生物中。植物miRNA通过剪切mRNA或抑制翻译的方式，负调控其靶基因的表达，在细胞增殖分化、个体生长发育、抗逆胁迫等生理过程中发挥关键作用。几十年来，科学家在动植物中发现了数万个miRNA，miRBase在2018年10月记录到38589个miRNA前体序列信息，这些前体序列共产生48860个不同的成熟miRNA，其中在人类基因组中鉴定到2654个，在拟南芥中鉴定到428个。miRNA可以参与调控植物多种生理过程，然而番茄miRNA在低温胁迫中的作用及其调控机制均鲜见报道。

发明内容

本发明实施例的目的是提供一种番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用，以解决现有冬春季节低温胁迫严重影响番茄产量的问题。

为了达到上述目的，本发明实施例所采用的技术方案如下：

第一方面，本发明实施例提供番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用，通过利用STTM技术构建的干扰载体使得所述番茄miR156e-3p基因的表达水平下降，所述番茄miR156e-3p基因的成熟体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，前体核苷酸序列为SEQID NO.2所示。

其中，前体核苷酸序列(又称为前体miRNA)的DNA片段的序列长度为105bp。

进一步地，通过利用STTM技术使得所述番茄miR156e-3p基因的表达水平下降，包括：

提取番茄总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，pre-F和pre-R为引物，扩增miR156e-3p前体序列，将扩增产物构建到植物过表达载体pFGC1008-HA上；其中，引物pre-F和pre-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示；

利用STTM技术设计特异性引物tgt-F和tgt-R，以cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物连接到pBWA(V)HS-amiRNA载体的Eco31I(BsaI)位点，构建出番茄miR156e-3p基因干扰载体；其中，特异性引物tgt-F和tgt-R的核苷酸序列如SEQ IN NO.5和6所示；