[发明专利]原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法及培养试剂盒

说明书

本发明涉及一种原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法及培养试剂盒，培养方法包括以下步骤：提供含有肢端黑色素瘤的组织样本；向所述组织样本注射吲哚菁绿后通过荧光成像确定肿瘤的位置，然后切割得到肿瘤组织块；将所述肿瘤组织块切碎后，加入胶原酶IV消化液和分散酶II消化液联合消化，收集消化液中的细胞并接种至培养基中进行培养。采用本发明的培养方法能够快速有效地获得可存活和传代的原代肢端黑色素瘤细胞，为研究相关药物反应和个体化治疗提供更好的工具，有助于促进相关生物学研究的探索和患者分子靶向治疗药物的鉴定。

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，特别是涉及一种原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法及培养试剂盒。

背景技术

黑色素瘤细胞在相关的生物医学研究中是必不可少的，而永生化黑色素瘤细胞系因其易培养、能在体外多代增殖而被广泛应用。但是，由于肿瘤的异质性，不同患者的肿瘤细胞往往具有不同的生物学特征，因而永生化黑色素瘤细胞系并不是可靠的肿瘤研究模型。尤其是肢端黑色素瘤，这是一个具有独特的临床、形态学和遗传学特征的不同于其他皮肤黑色素瘤的亚群。肢端黑色素瘤是非白种人人群中黑色素瘤的主要亚型，且占这些人群中所有黑色素瘤的多半以上。与其他黑色素瘤相比，肢端黑色素瘤侵袭力更强，患者生存率更低。大多数皮肤黑素瘤都有基因突变，常见的突变包括BRAF、NRAS或NF1突变，但是大多数肢端黑素瘤缺乏这些突变。此外，与其他皮肤黑色素瘤相比，肢端黑色素瘤具有广泛的结构变异和较低的突变负担。因此，永生化黑色素瘤细胞系并不是研究肢端黑色素瘤的理想模型，有必要进行肢端黑色素瘤原代细胞的培养。

发明内容

基于此，有必要提供一种简单有效的原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法。

一种原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法，包括以下步骤：

提供含有肢端黑色素瘤的组织样本；

向所述组织样本注射肿瘤靶向造影剂后通过荧光成像确定肿瘤的位置，然后切割得到肿瘤组织块；

将所述肿瘤组织块切碎后，加入胶原酶IV消化液和分散酶II消化液联合消化，收集消化液中的细胞并接种至培养基中进行贴壁培养。

本发明的培养方法使用近红外荧光染料吲哚菁绿辅助选取肿瘤组织，根据实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应，即实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性)，吲哚菁绿会在肿瘤部位富集，通过荧光成像能够快速准确地定位肿瘤的位置，从而尽量避免其他组织中其他细胞的干扰。而且，通过研究发现，由于肢端黑色素瘤组织质韧，不易消化，单纯采用物理剪切，肢端黑色素瘤细胞并不能自己从组织块中爬出来进行贴壁生长，因此该常用方法无法得到存活的原代细胞。在物理剪切的基础上，进一步使用胶原酶消化，发现消化时间较久，消化下的细胞依旧不能贴壁存活。通过不断探索研究实验条件，本发明的培养方法改进了消化获得单细胞悬液的方法，最终发现使用胶原酶IV和分散酶II联合消化效果最好，得到的细胞48h内可以逐渐贴壁，十几天后慢慢开始分裂增殖。采用本发明的培养方法能够快速有效地获得可存活和传代的原代肢端黑色素瘤细胞，为研究相关药物反应和个体化治疗提供更好的工具，有助于促进相关生物学研究的探索和患者分子靶向治疗药物的鉴定。

在一个具体示例中，所述肿瘤靶向造影剂为吲哚菁绿。

在其中一个实施例中，在所述消化的步骤中，所述胶原酶IV消化液中胶原酶IV的质量百分比为0.1％～0.3％，所述分散酶II消化液中分散酶II的质量百分比为0.05％～0.15％。

在其中一个实施例中，在所述消化的步骤中，消化时间为20min～40min。

在其中一个实施例中，所述培养基中含有完全培养基、5wt％的胎牛血清、80～120U/mL的青霉素、80～120U/mL的链霉素和1.0～1.5U/mL的制霉菌素。