[发明专利]非洲猪瘟病毒野毒感染与基因缺失毒株双重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒野生毒株感染与MGF505-2R基因缺失毒株双重荧光定量PCR检测组合物，其特征在于，由B646L基因的上游引物B646L-F1、下游引物B646L-R1和探针B646L-P1；MGF505-2R基因的上游引物MGF505-2R-F1、下游引物MGF505-2R-R1和探针MGF505-2R-P1组成；

所述引物和探针的序列如下：

上游引物B646L-F1：GGGTGCATGTCATTCATCCT；

下游引物B646L-R1：GTCATATCCGTTGCGAGGAA；

探针B646L-P1：FAM-AGGATGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCA-BHQ1；

上游引物MGF505-2R-F1：AGCTCTTGTTACTGTGGAAGG；

下游引物MGF505-2R-R1：AAAACGTTCTAAAGCGTGGC；

探针MGF505-2R-P1：VIC-ACGCCGTCATAGGAGCCTTGCAGGGTGA-BHQ1。

2.一种包含权利要求1所述的检测组合物的双重荧光定量PCR检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括探针法荧光定量检测试剂；内参染料ROX Reference Dye II；上游引物B646L-F1、下游引物B646L-R1、探针B646L-P1、上游引物MGF505-2R-F1、下游引物MGF505-2R-R1、探针MGF505-2R-P1；阳性对照：标准质粒pUC57-B646L和pUC57-MGF505-2R；阴性对照：双蒸水；所述探针法荧光定量检测试剂为探针法qPCR反应预混试剂Premix Ex Taq。

4.如权利要求3所述的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准质粒pUC57-B646L的基因拷贝数为2.9×10⁹拷贝/微升；标准质粒pUC57-MGF505-2R的基因拷贝数为1.5×10⁹拷贝/微升。

5.一种用于非诊断目的的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的DNA模板；

（2）采用权利要求1所述的检测组合物建立双重荧光定量PCR反应体系；

（3）进行荧光定量PCR检测，并生成标准曲线；

（4）待测样品的结果分析。

6.如权利要求5所述的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述双重荧光定量PCR反应体系为25μL，上游引物B646L-F1、下游引物B646L-R1、上游引物MGF505-2R-F1、下游引物MGF505-2R-R1的混合物共2μL，探针B646L-P1、探针MGF505-2R-P1的混合物共1μL，探针法qPCR反应预混试剂Premix Ex Taq 12.5μL，内参染料ROX Reference Dye II 0.2μL，标准质粒pUC57-B646L和pUC57-MGF505-2R的混合物2μL或待测样品的DNA模板5µL，加双蒸水补足至25μL。

7.如权利要求6所述的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，每种引物和探针的体积均为0.5μL，每种引物和探针的反应终浓度均为0.2µM，标准质粒pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R的体积均为1μL。

8.如权利要求6所述的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述反应体系的反应条件为95℃预变性20s，95℃变性3s，60℃退火30s，40个循环。