[发明专利]一种对虾肝肠胞虫LAMP-CRISPR等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种对虾肝肠胞虫LAMP‑CRISPR等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法。所述核酸序列组合，包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和探针。本发明检测方法，使用所述的试剂盒，检测方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，使用权利要求1中引物组进行LAMP等温扩增反应；(3)以步骤(2)LAMP等温扩增反应产物为模板，使用权利要求1中crRNA和探针进行CRISPR等温检测反应；(4)通过等温扩增仪对步骤(3)CRISPR等温检测结果进行分析，出现扩增曲线为阳性，否则为阴性。本发明检测方法快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便。

技术领域

本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及一种对虾肝肠胞虫LAMP-CRISPR等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法。

背景技术

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)属于微孢子虫科、肠胞虫属，2009年在泰国养殖的生长迟缓的斑节对虾(Penaeus monodon)中首次发现而命名。中国已经报道感染微孢子虫的对虾有凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、脊尾白虾(Palaemoncarincauda)以及中国明对虾(Fenneropenaeus chi-nensis)。感染EHP后一般不立即出现死亡，虾可正常摄食，但肌肉发白、肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，通常养殖30～45d以上才可发现生长缓慢，是近年来凡纳滨对虾生长缓慢的主要原因之一，严重影响了凡纳滨对虾的养殖生产。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的检测方法是减少肠胞虫病发生和危害的重要途径。

目前，对虾是否感染肝肠胞虫病的检验通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养和PCR等，这些方法耗时、耗力、操作复杂，很难适应当前快速、准确检测的需要。近年来，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplificationmethod，LAMP)技术和基因编辑技术的出现为其带来了一种更简便灵敏的检测方式，这是一种在恒温下可以快速检测的方法。

比如，公开号为CN106591474A的发明申请公开了一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，包括组织裂解液及LAMP扩增反应液，所述LAMP扩增反应液各组分如下：LAMP内引物各1.4mM，LAMP外引物各0.2mM，20mM Tris-HCl，10mM氯化钾，15mM硫酸铵，8mM硫酸镁，0.1％Triton X-100，0.6M甜菜碱，1.4mM dNTP，2.5U/μL Bst DNA聚合酶大片段，1.25mM钙黄绿素，25mM MnCl₂，水余量。所述LAMP外引物为引物对：引物EHP-F3和引物EHP-B3。所述LAMP内引物为引物对：引物EHP-FIP和引物EHP-BIP。该发明的试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的100倍，模板为10^-5倍稀释的基因组DNA有较模糊的条带。

再比如，公开号为CN107488730A的发明申请公开了一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒，设有组织裂解液、恒温荧光法反应液、阳性对照品和阴性对照品。所述恒温荧光法反应液的各组分组成为：引物EHP-OF 0.2μM，引物EHP-OB 0.2μM，引物EHP-IF 1.6μM，引物EHP-IB 1.6μM，引物EHP-LF 0.8μM，引物EHP-LB 0.8μM，Tris-HCl 20mM(pH8.4～8.6)，KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，MgSO₄ 2mM，Triton X-100 0.1％，Bst DNAPolymerase Large Fragment 8U，SYTO-9 4μM，余量为水。检出浓度可达10³个EHP/ml样品。

上述现有技术中检测灵敏度还比较低。

发明内容