[发明专利]一种快速筛选多环芳烃降解菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速筛选多环芳烃降解菌的方法，属于石油污染修复技术领域。利用Tecan infinite 200酶标仪、96孔板和2,6‑DCPIP试剂联合使用，从缩短筛选能降解多环芳烃的微生物的实验周期、控制有机溶剂的用量、使用痕量级的目标污染物和简化实验操作等四个方面优化现有的筛菌的方法。可以实现对具有多环芳烃降解能力的菌种的快速筛选，为石油污染的土壤修复提供尽可能多的菌种资源。

技术领域

本发明涉及一种快速筛选多环芳烃降解菌的方法，属于石油污染修复技术领域。

背景技术

2014年，我国土壤普查发现，典型地块及其周边土壤的主要污染物为石油烃和多环芳烃，超标点位占比均高于20.3％。大量复杂的石油碳氢化合物进入土壤后，会不可逆的破坏土壤的结构和功能，如改变土壤的粒度、孔隙率、渗透性和持水能力，改变土壤的肥力效用，诱发土壤中微生物群落定向变化。石油碳氢化合物易黏附于植物根系，从而影响植物对氧气、水分以及营养元素的吸收。PAHs具有很强的亲油性，会对内脏和脂肪组织造成损害，具有“三致”毒性，对成年鱼类、野生小型哺乳动物和人类都有免疫毒性效应。

目前，修复受污染土壤的方法有物理法、化学法和生物法等。物理法的优点在于设备简单、易于操作且效率高。但此过程实质上是污染物的转移，污染物的本质并未改变。化学处理法是添加外源药剂除去胶状或溶解性污染物的处理技术。化学处理法可高效处理突发高毒性污染事件，但长期处理低浓度石油碳氢化合物污染的土壤成本高，且易形成二次污染。生物法修复石油污染土壤技术就是利用动、植物及微生物自身对碳源的需求，从而使将石油烃类物质降解为挥发性有机物以及二氧化碳、水、氢气等无机物，进而达到修复土壤的目的。生物法由于操作简单、具有经济性、适应性强且无二次污染等优点，受到国内外重视。其中，微生物修复技术又是应用最为广泛的方法。

为了科学认识微生物在石油碳氢化合物污染土壤的环境中的作用，有必要优化现有方法，进而从石油碳氢化合物污染的土壤中快速分离出对PAHs具有高效降解作用的菌种。

目前石油降解微生物筛选的方法普遍分为以下几步：(1)用液体培养基在适宜温度和转速的生物摇床中富集微生物；(2)用固体培养基在适宜温度的恒温培养箱中培养，并分离和纯化形态差异较大的菌种；(3)配制含有目标污染物的无机盐培养基，其中目标污染物为唯一碳源，投入分离出的菌种，在适宜的温度和转速的生物摇床中培养，多次传代驯化培养；(4)通过溶剂提取法从锥形瓶中提取剩余的目标污染物，进而判断该菌种对石油碳氢化合物的降解能力。

但是，上述方法仍存在如下问题：(1)从污染的环境中分离得到可能对石油碳氢化合物有降解能力的菌种，通过多次传代反复筛选后，确定该菌为石油碳氢化合物降解菌需要较长的时间，多次传代培养容易造成微生物性状的变化和优势性状的丢失；(2)实验中为了尽可能的提取锥形瓶中剩余的目标污染物，往往需要使用大量的有机溶剂，浪费成本并产生不必要的污染，且这些有机溶剂通常具有挥发性和毒性，对研究人员的身体健康有害；(3)重量法测定剩余目标污染物不准确，而精密仪器(如CG-MS、LC-MS等)分析法对仪器精度、色谱柱的选择、标准曲线的配制和研究人员的操作均有较高的要求；(4)需要使用一定量的PAHs或原油等石油碳氢化合物作为目标污染物。

发明内容

针对现有方法的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种Tecan infinite 200酶标仪、96孔板和2,6-DCPIP试剂联合使用的方法，其目的在于使用微量的实验药品快速分离出对PAHs具有高效降解作用的菌种，为石油烃土壤修复提供尽可能多的菌种资源，并为后期制作土壤石油污染原位修复菌剂提供支持，减少实验过程中不必要的污染产生的问题。

本发明的具体步骤如下：

1.实验试剂

实验试剂包括萘、蒽、菲、芘、荧蒽、正己烷和2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP)。

2.培养基配制