[发明专利]稀有鮔鲫运甲状腺素蛋白基因、蛋白序列及其应用

说明书

本发明公开了一种稀有鮔鲫运甲状腺素蛋白基因、蛋白序列及其应用。本发明通过直接克隆技术，从稀有鮔鲫肝脏中克隆获得了稀有鮔鲫运甲状腺素蛋白基因cDNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的运甲状腺素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的稀有鮔鲫运甲状腺素蛋白可用于筛选水中对水生生物产生内分泌干扰的化学物质，以及研究水中化学物质对于生物体的干扰机制。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种稀有鮔鲫运甲状腺素蛋白（TTR）基因、蛋白序列及其应用。

背景技术

在脊椎动物中，鱼类占主要比例，其分布几乎涵盖了所有水生生态系统。硬骨鱼类占脊椎动物物种的一半以上，并适应各种海洋和淡水环境。由于许多物种在水生食物链中位居前列，鱼类可能通过食用而直接影响人类健康。因此，鱼类通常用于体内测试。国际标准化组织（ISO）已推荐斑马鱼、黑头呆鱼、虹鳟鱼和青蒿作为水生试验物种。由于物种差异性和许多潜在的污染物可能直接释放到中国的生态系统中，因此有必要使用中国本土物种开展体内筛选试验以进行化学安全性评估。

稀有鮔鲫（Gobiocypris rarus）是一种小型的鲤科鱼类，全长30~80 mm，主要分布在四川省长江上游水域。它们的特点是生命周期短，适应温度范围广，易人工培养。与ISO推荐的毒性材料实验鱼斑马鱼相比，稀有鮔鲫的胚胎发育时间更短，更有利于胚胎学研究。2014年，《GB/T 29763-2013 化学品-稀有鮔鲫急性毒性试验》首次把稀有鮔鲫作为中国的标准模式生物。因此，作为水生毒理学新兴模型的稀有鮔鲫在未来会更广泛地用于化学安全评估和环境毒理学研究。

甲状腺激素（THs）包括甲状腺素（T₄）和三碘-L-甲状腺素（T₃），它们在维持脊椎动物稳定的生理状态中起着至关重要的作用。在脊椎动物中，组织和生物功能的大多数活动受THs的影响。THs与多种功能有关，如繁殖和行为，发育和生长，代谢等。在鱼类中，运甲状腺素蛋白（TTR）是关键的THs载体蛋白。然而，已经有研究发现水体中化学物质的暴露会使得甲状腺激素的合成，转运，相互作用受到影响。因此有必要研究水体中存在的化学物质与TTR的相互作用，从而判断该化学物质对于水生生物内分泌系统的干扰。

发明内容

本发明通过直接克隆技术，从稀有鮔鲫肝脏中克隆获得了稀有鮔鲫TTR基因cDNA序列，并对其进行氨基酸理化性质分析、信号肽预测、一级、二级、三级结构预测和同源性分析。最后对其进行表达纯化，并应用于筛选水体中存在的内分泌干扰物。

本发明提供稀有鮔鲫运甲状腺素蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。稀有鮔鲫运甲状腺素蛋白基因的克隆方法，包括以下步骤：（1）稀有鮔鲫总RNA的提取；（2）cDNA的反转录合成；（3）运甲状腺素蛋白基因的PCR扩增；（4）琼脂糖凝胶电泳检测；（5）运甲状腺素蛋白基因的回收与鉴定；（6）运甲状腺素蛋白基因的克隆与鉴定；（7）测序；其中步骤（3）PCR扩增以及步骤（7）测序引物的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示，其序列信息如下：

SEQ ID NO:3：5'-ATGGCTAAAGCAGTGATTTGTGT-3'，

SEQ ID NO:4：5'-TCACTCGTGTGCTTTGACGAC-3'。

本发明还提供分离出的稀有鮔鲫运甲状腺素蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，本发明提供上述稀有鮔鲫运甲状腺素蛋白在筛选水中对水生生物产生内分泌干扰的化学物质中的应用。

在本发明的具体实施方式中，所述的化学物质为2,4,6-三溴苯酚、2,4,6-三碘苯酚、3,5-二氯水杨酸、3-溴-5-氯水杨酸、3,5-二溴-4-羟基苯甲酸或2,3,5-三碘苯甲酸。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：