[发明专利]一种五味温通除痹胶囊质量评价方法

权利要求书

1.一种五味温通除痹胶囊质量评价方法，其特征在于，步骤为：

（1）结合血清药物化学和UHPLC-QTOF-MS技术追踪五味温通除痹胶囊入血成分并靶向其质量标志物

（a）利用茯苓、桂枝、淫羊藿、片姜黄和黄芩5味中药按处方比例制备复方五味温通除痹胶囊，并将五味温通除痹胶囊提取物制成冻干粉，用于大鼠灌胃和后期样品分析；

（b）动物模型构建与给药

选取SPF级雄性SD大鼠，于右后足趾皮内注射FCA复制佐剂性关节炎大鼠模型；五味温通除痹胶囊治疗组于注射FCA后第12天进行实验，五味温通除痹胶囊汤剂连续灌胃12天；对照组和模型组大鼠给予等量0.9%生理盐水；

（c）血清样本的收集与处理

末次给药后8 h，用异氟醚对大鼠进行深度麻醉，腹主动脉采血，室温静置1-2 h后离心，取上清液，-80 ℃储存，备用；分析前，将血清样品与甲醇-乙酸乙酯混合均匀，离心，浓缩干燥处理；干燥后的样品使用甲醇复溶，取2 μL试样用于UHPLC-QTOF-MS分析；

（d）基于UHPLC-QTOF-MS技术进行血清成分定性分析

①色谱条件

色谱分析流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；

梯度洗脱程序为：0-1 min，10% B；5-8 min，15% B；10-15 min，22% B；18-21 min，35%B；22-24 min，70% B；25-27 min，95% B；28-30 min，10% B，流速为0.25 mL / min；

②质谱条件

质谱分析在正、负离子模式下进行，扫描范围为m/z 50~1200，数据采集速率为0.5 s；正离子模式下毛细管电压为2.5 kV，源温度为120 ℃；负离子模式下毛细管电压为2.0 kV，源温度为110 ℃；锥孔电压为40 kV，脱溶剂气流温度为350 ℃，锥孔气流量为50 L/h；

通过锁定喷雾实时调节QTOF-MS中获得的所有离子的质荷比m/z，选取亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量化合物，进行正离子模式[M+H]⁺：m/z 556.2771和负离子模式[M-H]^-：m/z554.2615检测；

③标准品UHPLC-QTOF-MS分析

选择肉桂醇、肉桂醛以及肉桂酸作为中药桂枝中苯丙素类化合物代表性组分，选择黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素以及汉黄芩苷作为中药黄芩中5,7-二羟基异黄酮类化合物代表性组分，选择脱水淫羊藿素、宝藿苷I、朝藿定C以及淫羊藿苷作为中药淫羊藿中8-异戊烯基异黄酮类化合物代表性组分，选择茯苓酸作为中药茯苓中四环三萜酸类化合物代表性组分，选择吉马酮作为中药片姜黄中倍半萜类化合物代表性组分；

取13种标准物质在上述质谱条件下，通过QTOF-MS仪进行检测，记录各标准品的保留时间信息，并通过质谱裂解碎片信息分析，总结出不同类型化合物的裂解规律；

④血清样品UHPLC-QTOF-MS分析

将各组血清样品、复方五味温通除痹胶囊提取物分别在上述质谱条件下，通过QTOF-MS仪进行检测；根据测量值与理论值偏差小于10 ppm，同位素拟合程度小于1.0的原则，利用质谱仪自带的质量体系元素组成计算工具，得到各谱峰对应的分子式；最后通过标准品碎片裂解规律和数据相结合，鉴定出复方五味温通除痹胶囊入血成分，并从中选定香豆素、黄芩苷、朝藿定C、淫羊藿苷、肉桂酸、汉黄芩苷、肉桂醛、黄芩素、肉桂醇、2-甲氧基肉桂醛、汉黄芩素、宝藿苷I、脱水淫羊藿素、吉马酮、茯苓酸共计15种物质作为质量标志物；

（2）15种质量标志物的全波长扫描

先用空白溶液将UV-2550分光光度计调零，然后将制备的15种标准品母液稀释至适当浓度后，进行全波长扫描检测，得到其吸光度数据；综合15种标准物质的最大吸收波长数据，最终选择203 nm和270 nm两种波长对复方五味温通除痹胶囊进行全面的质量评价；

（3）UHPLC-UV分析方法的建立

样品分析采用UHPLC系统，配备自动进样器、泵、柱温箱、紫外检测器，使用Eclipse 型C₁₈柱，1.8 μm，2.1 mm×100 mm，Agilent，流速为0.4 mL/ min；柱温和样品室温度分别保持在25 ℃和10 ℃；进样量为1μL；

系统I：针对除了茯苓酸之外14种质量标志物，紫外检测器在270 nm处进行检测，UHPLC的流动相：A为含0.2%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5 min，15% B；7-12min，20% B；14-19 min，23% B；25-30 min，28% B；32-37 min，35% B；39-44 min，44% B；49-54 min，62% B；55-59 min，100% B，59 min后停止，平衡系统4 min后再进样；

系统II：针对茯苓酸，紫外波长设置为203 nm，UHPLC的流动相：A为含0.2%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5 min，30% B；6-9 min，62% B；10-16 min，23% B；16 min后停止，平衡系统3 min后再进样；

（4）UHPLC-UV分析方法的验证

利用步骤（3）的分析方法，建立线性回归方程，确定检出限和定量限，同时，开展精密度、重复性、稳定性和回收率测试，进行方法学验证，综合评价分析方法的可靠性；

（5）五味温通除痹胶囊样品的分析

采用所建立的UHPLC-UV法对多批五味温通除痹胶囊样品中的15种质量标志物进行了定量测定，在270nm下对五味温通除痹胶囊进行指纹分析，构建其指纹图谱，完成对五味温通除痹胶囊的全面质量评价。