[发明专利]生长细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法

说明书

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种生长细胞法制备孕甾‑5‑烯‑3β,21‑二醇的方法。发明内容包括(1)植物甾醇的3位保护、(2)生长细胞转化、(3)提取、(4)水解、(5)精制步骤。本发明的制备方法成本较低，路线更短，省掉了许多反应步骤和后处理步骤，反应路线的缩短也有利于反应收率的提高，减少中间损耗。本发明采取3位羟基保护的步骤在前，生长细胞生物发酵反应在后，直接加大了发酵底物在发酵液中的溶解度，有利于发酵的进行，可提高产物的收率，减少杂质的产生。本发明的制备方法还能减少化学试剂的使用，有利于环境保护。

技术领域

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种生长细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法。

背景技术

孕甾-5-烯-3β,21-二醇是甾体合成中重要的中间体，传统的工艺是利用3位酮基的类似结构，用化学方法选择性还原3位酮基为β羟基得到的产品，常常带有一定量的3位α羟基异构体，收率低且步骤繁琐，使用多种有机试剂容易带来污染。

菌株Mycobacterium sp.B-NRRL 3683记载在美国专利号为4755463的文献中，一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵，目前普遍的研究是通过控制反应条件来提高4-AD和ADD的收率。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种高收率，高质量，低污染，易操作的生长细胞转化植物甾醇制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种生长细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，包括以下步骤：

(1)3位羟基保护反应：利用甲缩醛作为保护剂，将植物甾醇的3位羟基进行保护，得到植物甾醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；

(2)生长细胞生物转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中，对所述植物甾醇醚化物进行发酵转化，得到发酵产物；

(3)水解：将所述发酵产物用乙酸乙酯萃取，减压升温浓缩后用盐酸水解，得水解产物；

(4)精制：将所述水解产物进行精制提纯，得到孕甾-5-烯-3β,21-二醇产品。

进一步地，所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种种子培养的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；

(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；

(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；

(4)种子罐培养：

培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，按上述配方配制培养基，121℃灭菌30min；将二级种子液按体积比10％接种至种子培养基，培养参数：于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌速度50-500rpm，罐压0.05-0.06MPa条件下培养，培养时间14-96h。