[发明专利]一种体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种体外培养HEK293用于瞬时表达蛋白的方法，包括如下步骤：S1：将冻存的HEK293细胞在原始培养基里复苏，培养箱中孵育；S2：将细胞接种到HEK293无血清培养基中进行培养；S3：传代操作；S4：再次传代操作；S5：准备转染质粒；S6：获取包括细胞密度和存活率的数据并稀释细胞；S7：稀释质粒DNA；S8：稀释转染试剂；S9：将稀释后的转染试剂加到稀释后的质粒DNA中，将混合物在室温下孵育；S10：将混合物缓慢添加至步骤S6的细胞中摇动；S11：放入培养箱培养，收获HEK293细胞和表达产物。本发明可明显提高表达量，表达效率高，在更短的时间获得更多的蛋白。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，更具体地说，尤其涉及一种无血清HEK293培养基用于体外培养瞬时表达蛋白的方法。

背景技术

HEK293细胞是抗体和重组蛋白表达的重要平台。根据表达的时间不同，可将基因产物表达分为瞬时表达与稳定表达。稳定表达是抗体药物生产系统的金标准，不过其过程耗费时间长，费用高，不利于大通量、高效率地筛选新的抗体药物。瞬时基因表达技术是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合至染色体，较短时间内就可获得目的基因的表达产物，但随着细胞的分裂增殖，这种外源基因最终会消失，表达持续时间为几天到两周。此技术大大缩短了微量至中等量重组抗体的生产过程，从而为抗体药物的快速生产、早期筛选和功能、毒理分析提供有效的手段。

瞬时基因表达技术常用的宿主细胞有HEK293细胞、CHO细胞等，HEK293细胞具有生长速度快，易于转染等优点，在抗体药物的快速高效表达和功能分析时，具有很好的优势。因而HEK293的瞬时表达已成为生物制药企业常用技术平台之一。不过瞬时表达虽然具有快速、简便、易操作的特点，但是蛋白产量往往不太理想。目前，市场上缺乏一种利用无血清HEK293培养基用于体外培养高效瞬时表达蛋白的方法。另外，目前HEK293培养基市场为SIGMA、Invitrogen、Hyclone和Lonza等国际知名培养基占领，价格昂贵，每升高达上千元，不利于企业降低成本。故开发一种使用自主品牌且低成本的无血清无动物来源培养基进行HEK293高效瞬时表达的方法，对于抗体药物的产业化的意义是非常重大的。

发明内容

本发明提供了一种使用无血清HEK293培养基用于体外培养高效瞬时表达蛋白的方法。

为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种无血清HEK293培养基用于体外培养瞬时表达蛋白的方法，包括如下步骤：

S1：将冻存的HEK293细胞在原始培养基里复苏，将HEK293细胞在37℃培养箱中孵育；

S2：当细胞活率≥95％且生长处于对数中期时，开始进行驯化程序；

S3：每2-3天进行一次传代操作，以保持HEK293细胞处于早期对数生长期，细胞接种密度为0.3～0.6×10⁶细胞/mL；

S4：当细胞密度达到3～4×10⁶细胞/mL且细胞活率≥95％，2～4天时，再次传代培养HEK293细胞；

S5：细胞密度达到约3～4×10⁶个活细胞/mL，活率≥95％时，准备转染质粒，转染前一天，将HEK293细胞按2～4×10⁶细胞/mL细胞密度接种，并使HEK293细胞生长过夜；

S6：在第二天(转染当天)，获取包括细胞密度和存活率的数据，进行转染的细胞活率应≥95％，使用新鲜的培养基将细胞稀释至2～4×10⁶细胞/mL；

S7：稀释质粒DNA，通过旋转和/或翻转混匀；

S8：将转染试剂充分混匀，并用培养基稀释转染试剂，通过旋转和/或翻转来混合；